[摘要] 目的 观察5种龈下微生物检出水平与慢性牙周炎局部牙周状态的关系。方法 选择20例慢性牙周炎患者的80个位点及10例牙周健康者的20个位点为观察位点，采集龈下微生物样本，记录牙周探诊深度（pd），根据所测位点的pd进行分组。pd≤4 mm为a组，4 mm6 mm为c组，健康对照组为h组。通过聚合酶链反应（pcr）和dna探针反杂交技术半定量检测各组伴放线菌嗜血菌、牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体和中间普氏菌的检出率和检出水平。结果 b、c组牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体和中间普氏菌的检出率和检出水平均高于h组，a组牙龈卟啉单胞菌的检出率和检出水平也高于h组，c组福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体检出水平高于b组，以上差异均有统计学意义（p<0.05）；伴放线菌嗜血菌在各组间的检出率及检出水平都无明显差异。结论 随着牙周袋的加深，牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体和中间普氏菌体的阳性检出率和检出水平都有随之增加的趋势；牙龈卟啉单胞菌与慢性牙周炎的早期炎症关系较为密切，而福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体与中重度慢性牙周炎炎症位点的严重程度有关。
　　[关键词] 慢性牙周炎； 牙周致病微生物； 聚合酶链反应
　　[中图分类号] r 739.86 [文献标志码] a [doi] 10.7518/hxkq.2013.05.018
　　菌斑是慢性牙周炎的始动因子，其中龈下菌斑与牙周炎症的关系最为密切。组成龈下菌斑的微生物种类繁多，不同微生物之间相互作用、相互影响。研究表明，牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、中间普氏菌、伴放线菌嗜血菌和齿垢密螺旋体被认为是龈下菌斑中主要的可疑致病微生物，与慢性牙周炎关系密切[1]。本实验采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，pcr）和dna探针反杂交技术，半定量检测慢性牙周炎患者和牙周健康患者龈下菌斑中上述5种牙周可疑致病微生物的分布情况，观察这5种微生物与不同牙周状态之间的关系。
　　1 材料和方法
　　1.1 研究对象
　　从贵州省人民医院口腔科门诊就诊患者中随机选取20例临床诊断为慢性牙周炎（根据armitage1999年新分类诊断）的患者，男性9例，女性11例，年龄32～57岁。在本科室工作人员和实习学生中选取10例牙周健康者为对照组，其中男性4例，女性6例，年龄21～33岁。所有研究对象至少有20颗天然牙，且每个象限都余留有天然牙；无任何影响牙周炎进程的全身性疾病；3个月内未接受过牙周治疗或1个月内未服用过抗生素。受试者均签署知情同意书。
　　1.2 临床检查、样本收集及分组
　　由经过牙周专业培训的医生使用williams探针严格按牙周探诊的操作要求对两组研究对象进行全口牙周探诊检查。牙周炎组选择每个象限牙周探诊最深的位点作为检测位点（共80个），对照组选取a6和d6的近中颊侧位点作为检测位点（共20个）；记录所选位点的牙周探诊深度（probing depth，pd）。选好位点后，用手工刮治器先去除龈上菌斑及牙石，棉卷隔湿，先后用2根40号无菌纸尖分别插入牙周袋底，各停留20 s取出，放入无菌1.5 ml eppen-dorf管中，-20 ℃保存，备用。所有研究对象的检查及取样均由同一名医生完成。根据pd的不同分组：a组（pd≤4 mm）、b组（4 mm6 mm），以及h组（健康对照组）。
　　1.3 试验步骤
　　1.3.1 dna的提取 利用试剂盒high pure pcr tem-plate preparation kit（roche diagnostics公司，德国）提取dna，-20 ℃保存，备用。
　　1.3.2 pcr扩增样本dna 将提取的样本dna采用pcr方法进行扩增。dntp和生物素标记的引物由microdent?kit（hain diagnostik gmbh公司，德国）提供。反应体系：5 ?l pcr buffer，5 ?l 25 mmol·l-1 mgcl2，1 ?l taq酶，35 ?l引物和dntp的混合物，5 ?l样本dna，阴性对照则加入5 ?l无菌双蒸水。反应条件：预变性95 ℃ 5 min，变性95 ℃ 30 s；58 ℃ 2 min，10个循环，变性95 ℃ 25 s，退火53 ℃ 40 s；延伸70 ℃ 40 s，20个循环；70 ℃ 8 min，1个循环。
　　1.3.3 dna探针反杂交技术检测 将pcr反应产物用microdent?kit（hain diagnostik gmbh公司，德国）进行反杂交，将已有生物素标记的pcr扩增产物变性解链，加入杂交液，45 ℃下与已固定有2个阳性对照带（一个表示pcr正常进行，见图1中ac；另一个表示反杂交正常进行，见图1中cc；2个阳性对照带在每个样本的结果中都必须

出现）和5个牙周致病微生物特异dna探针的硝酸纤维膜孵育30 min，当样本中的牙周致病微生物pcr扩增产物和与之互补的特异dna探针结合后，洗涤去除与探针非特异结合的dna，然后加入细菌蛋白—碱性磷酸酶复合物及其底物，使特异结合在硝酸纤维膜上的生物素标记的牙周致病微生物pcr扩增产物显紫蓝色。微生物半定量检测结果如图1所示：根据杂交带上不同位置区分微生物种类，以染色带的深浅代表细菌量的差异。由同一观察者按+++（与杂交反应对照带一致），++（介于+++与+之间），+（弱显色），-（未见显色）4个等级进行判定。
　　1.4 统计方法
　　使用spss 17.0统计软件对结果进行统计分析。以不同组别的位点为统计对象，微生物检出率的比较采用卡方检验或确切概率法；检出量按+++、++、+、-分为4个等级，采用非参数检验的秩和检验进行比较。检验水准为双侧α=0.05。 　　2 结果
　　2.1 5种微生物的检出率
　　5种龈下可疑致病微生物在各组的检出率如表1所示。伴放线菌嗜血菌的检出率在慢性牙周炎各组及h组的差异均无统计学意义（p>0.05）。牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体和中间普氏菌b、c组的检出率均高于h组，其中福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体b、c组检出率亦高于a组（p<
　　0.05）。a组只有牙龈卟啉单胞菌的检出率高于h组（p<0.05）。
　　2.2 5种龈下微生物的检出水平
　　5种龈下微生物在各组间的半定量检出水平见表2。h组牙龈卟啉单胞菌的检出位点数显著低于牙周炎各组（p<0.05）。h组与a组福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体和中间普氏菌的检出位点数均少于b、c组（p<0.05），而福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体在b、c组间的检出位点数也有差异（p<0.05）。4组伴放线菌嗜血菌的检出水平无明显差异。
　　3 讨论
　　本研究发现，除伴放线菌嗜血菌外，其余4种微生物在b组（4 mm
　　6 mm）都有较高的检出率，均高于对照组，且都有随牙周袋的加深而增加的趋势，说明这4种微生物与牙周炎的发生发展密切相关，与其他学者的研究结果一致[2-3]。牙龈卟啉单胞菌在a组（pd≤4 mm）的检出率较对照组高，且高于其余4种微生物在该组的检出率，提示牙龈卟啉单胞菌在轻度慢性牙周炎的龈下菌斑中较其他4种微生物更具优势。
　　本研究中，5种微生物在牙周健康组都有一定量的检出，但检出率较牙周炎症位点低。关于牙周可疑致病菌是否为牙周常驻菌的争论一直存在，其在牙周健康者或健康位点的检出率也不尽相同。wara-aswapati等[2]通过pcr方法进行检测，发现牙周健康者牙龈卟啉单胞菌、伴放线菌嗜血菌、齿垢密螺旋体和福赛斯坦纳菌的检出率分别为45%、6%、10%和0%；van winkelhoff等[4]通过传统培养法，以x线片无牙槽骨吸收作为牙周健康的纳入标准，发现在牙周健康者福赛斯坦纳菌、中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌和伴放线菌嗜血菌的检出率分别为47.9%、69.1%、10.6%和12.8%；而klein等[5]采用pcr方法在牙周健康者没有检出福赛斯坦纳菌和牙龈卟啉单胞菌，在牙周炎患者的健康位点也没有检出福赛斯坦纳菌，牙龈卟啉单胞菌也只在其中1个位点被检出。马丽等[6]采用pcr方法检测2型糖尿病患者龈下菌斑中的福赛斯坦纳菌，发现重度牙周炎的检出率（67.39%）明显高于轻度（47.82%）和中度（48.71%）牙周炎，而在牙周健康组未检出。由此可见，龈下菌斑微生物检出率的差别主要是由于检测方法和检测对象的纳入标准不同而产生的。
　　与微生物的检出率相比，微生物的检出量或特定微生物在龈下菌斑中所占的比例与局部牙周炎症的程度及发展预后关系更为密切[7]。有学者[8]提出，牙周致病微生物的量要超过宿主的阈值才可能导致牙周炎症的发生和发展。van winkelhoff等[4]通过传统培养法发现，伴放线菌嗜血菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌和福赛斯坦纳菌的平均检出量在牙周炎组均高于健康对照组，且牙龈卟啉单胞菌和福赛斯坦纳菌在总检出量中所占比例显著高于健康对照组。mineoka等[9]通过定量pcr方法发现，pd≥
　　4 mm且探诊出血阳性位点的牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体检出量明显多于pd<4 mm或探诊出血阴性的位点，3种微生物在数量上有明显的相关性。杨禾等[10]也发现，龈下菌斑中福赛斯坦纳菌的数量与牙周状况有密切关系。本研究发现，a组只有牙龈卟啉单胞菌的检出水平与健康对

组有明显差异，但是随着牙周袋的加深，b、c组牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体和中间普氏菌的检出水平都较对照组高，提示牙龈卟啉单胞菌的出现可能导致局部发生牙周炎症，而后三者的出现则促进了牙周局部炎症的发展。这一结果印证了其他学者[11]对龈下菌斑红色复合物的描述：牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体三者在龈下菌斑中的关系密切，在牙周炎的发生发展有重要作用。本研究还发现，虽然b、c组福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体的检出率无明显差异，但c组的检出量明显高于b组；该结果提示，相对于阳性检出率而言，这两种微生物量的增加更为重要。
　　综上所述，牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体和中间普氏菌在pd>4 mm位点都有较高的检出率和检出量，其检出水平随着牙周袋的加深而增加；牙龈卟啉单胞菌与早期慢性牙周炎的发生较为密切，而福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体与中重度慢性牙周炎局部炎症的严重程度有关。
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　　（本文编辑 吴爱华）