摘要：采用优化土著微生物菌群的生物技术，开展了华北濮阳地区石油污染地下水的修复实验。选择优化出的菌群包括假单胞菌属、微球菌属、放线菌属、真菌类的青霉属、曲霉属；实验过程中，分别在石油含量为1820 mg/l、8625 mg/l、1 6950 mg/l污染水中加入了15%的优化菌群制剂。经过28 d、37 d、37 d的修复实验，三种浓度中石油污染物的最大累计去除率分别为5346%（28 d）、7087%（37 d）和5819%（37 d），和对照5%的净化率相比，加入优化菌群制剂显著提高了石油污染物的去除率；温度是影响修复效果的因素之一，30 ℃是该菌群的最佳生长温度，对油污地下水的修复效果最明显，浓度是影响石油污染物浓度的另一重要因素。
关键词：土著微生物；修复；石油污染；温度；浓度
1672-1683（2010）06-0056-03experimental study on indigenous microbial remediation of oil-contaminated groundwater
chen li1，2,zhang fa-wang1,zhang lin1,zhang juan-juan3
(1.the institute of hydrogeology and environmental geology,chinese academy of geological sciences,shijiazhuang 050061,china;2.china university of geosciences,beijing,100083,china;3.shijiazhuang university of economics,shijiazhuang 050000,china)
abstract: using optimized indigenous microbial flora biotechnology, we had conducted repair experimental research on oil-contaminated groundwater in puyang area of north china. the selected optimized flora include pseudomonas, micrococcus, actinomyces, fungi such as penicillium and aspergillus; in experiment process, add 1.5%'s optimized flora preparation into the polluted waters with oil content of 182.0mg / l, 862.5mg / l and 1695.0mg / l. after 28 days，37days and 37 days remediation experiments, the maximum cumulative removal rates of oil pollutants in the three concentrations are 53.46% (28d), 70.87% (37d) and 58.19% (37d). the temperature is one of the remediation affecting factors and 30℃ is the best flora growth temperature, with the most significant remediation effect on oil-contaminated groundwater; concentration is another important factor influencing oil pollutants; in sterile contrast experiment, the removal rate of oil pollutants is within 5%, indicating slow groundwater oil degradation in natural conditions.
key words: microbial remediation; oil; contaminated groundwater; temperature ; concentration
石油开采过程中井下作业、油气集输、垃圾堆积以及事故等都会造成油类经包气带进入地下水中，危害地下水资源［1-2］。国际上对修复石油类污染地下水的问题开展较早，在20世纪80年代，美国建立地下水土污染“超级基金”治理项目［3-4］。其中绝大部分用于治理石油及其衍生物污染，欧洲一些国家也在此方面大量投资进行修复，并取得一定效益［5-8］。国内地下水污染较重，但大多侧重于对其污染物的成分分析以及对其迁移和转化进行模型预测的分析［9-11］。而修复技术的研发起步较晚，且大多集中在物理和化学方法［12-14］。微生物的方法研究技术近些年取得了明显进展。微生物修复技术主要机理是石油烃直接参与了微生物的生化反应,通过代谢作用降解土壤中的污染物［15］。
本研究是通过对华北濮阳地区石油污染土壤与地下水调查采样，利用优化筛选出的各类土著微生物菌群，进行了地下水石油污染的室内模拟降解实验，为现场修复地下水奠定了技术基础。
1 实验材料和方法
1.1 材料
化学试剂： mgso.4·7h.2o、 nh.4no.3 、cacl.2、fecl.3、kh.2po.4、k.2hpo.4、kcl、（nh.4）.2so.4、 caco.3、nacl、可溶性淀粉、蔗糖、乳酸、盐酸、琼脂、液体石蜡等，上述试剂为培养基和实验添加成分。石油醚、三氯甲烷等分析石油用试剂，均为分析纯。
原油：中原油田采油五厂油田地下2 400 m采出。
培养基：新鲜马铃薯；
菌种筛选水：濮阳地区石油污染地下水样品；
试验用水：蒸馏水（ph为72，tds为370 mg/l）。
1.2 石油含量测试方法
石油含量分析测试采用紫外分光光度法（gb/t 57507-2006），最低检测限为0005 mg/l。ph值采用phb-3 型ph计测定，tds用ddb-303a型电导率仪测定。
1.3 降解细菌的培养方法
石油降解细菌的培养优选方法如下：地下水微生物细菌依照《水生微生物学实验法》［16］，土壤微生物细菌培养采用《土壤微生物研究法》 ［17］和参考文献［18-19］介绍的方法，细菌初步鉴定用《常见细菌系统鉴定手册》［20］中的方法。
1.4 修复方法与步骤
1.4.1 石油降解菌的分离与优选
用细菌的选择性培养基和富集培养基，对油田采油井周围石油污染地下水的样品进行菌种、菌群的培养分离，优化选择出降解石油污染的菌种、菌群。试验选择优化出的细菌根据《常见细菌系统鉴定手册》中的方法初步鉴定主要为：细菌类（a），假单胞菌属、微球菌属：放线菌类（b），放线菌属；真菌类（c），青霉属、曲霉属等菌群。
将上述选出的优势菌群，利用不同的培养基进行扩大培养。各类菌群培养3~5 d后，再按等份进行3~7 d混合培养，以便备用。
1.4.2 试验步骤
在150 ml三角瓶分两批次实验，每批次实验温度和石油含量不尽相同。第一批次（实验时间为2008年5月20日至6月17日）设3个温度梯度，分别为25 ℃、20 ℃、15 ℃，每个温度梯度下石油含量为1820 mg/l，以不添加石油为对照；第二批次（实验时间为2008年6月27日至8月12日）设4个温度梯度，分别为35 ℃、30 ℃、25 ℃和20 ℃，每个温度梯度下设两个石油浓度，分别为8625 mg/l和1 6950 mg/l。所有处理设7个重复。
在121 ℃下，将三角瓶灭菌30 min，然后在每个瓶中加入20 ml用地下水配制的无菌培养液。在第一批次三角瓶中加入含1%石油的石油醚乳剂20 ml，与无菌培养液混合后用氮气吹脱石油醚，测得其石油含量为1820 mg/l；第二批次实验中，一部分三角瓶中加入含10%石油的石油醚乳剂10 ml，与无菌培养液混合后用氮气吹脱石油醚，测得石油含量为8625 mg/l，一部分三角瓶中加入含10%石油的石油醚乳剂20 ml，与无菌培养液混合后用氮气吹脱石油醚，测得石油含量为1 6950 mg/l。接着每瓶按15%接入菌液制剂，用棉塞封口，每天以转速50 r/min摇床培养2 h，一定的时间各取出一瓶样品，分析石油含量。
2 结果与讨论
2.1 石油污染物的去除率
第一批次实验结果见表1。表1 第一次实验中石油污染物降解率随时间变化table 1 results of oil contengts with time during bacterial degradation in oil contaminated groundwater for first batch
（%）
温度（℃）实验天数/d0357101328
25022.2530.2231.0442.9149.1253.46
20011.2615.9317.0334.8436.5441.21
1507.9712.3614.9516.4819.6227.47
20(对照)00.160.881.042.423.744.95
表1显示,加入菌剂对地下水中石油污染物有降解作用。在选择的3个温度中，经过28 d的降解，降解率超过了2747%。对照样品中的石油含量变化不大，在5%以内，说明在同等温度无菌条件下短时间内地下水中石油降解是缓慢的。
第一次实验发现，随温度升高，石油污染物累计降解率也在升高。因此，第二次实验增加了两个温度的设置，且石油污染物的浓度加大，实验时间延长，结果见表2。 表2 第二次实验中石油污染物降解率随时间变化结果table 2 results of oil contengts with time during
实验结果进一步验证了微生态细菌在地下水石油污染中的修复作用。在选择的4个温度中，经过37 d的降解，降解率超过了4186%。对照样品中的石油含量变化不大，在3%以内，说明在同等温度无菌条件下短时间内地下水中石油降解是缓慢的。在同等条件的平行实验效果也基本一致，得到了相互验证的效果。
2.2 温度对石油污染物去除率的影响
温度是影响微生物生存的重要因素之一，微生物的活动强度、生化作用都与此相关，环境中的微生物均在一定的温度范围内生存，温度的适中可使细菌细胞中的生物化学反应速率加快。
由两次实验可知，第一批次实验效果不明显，石油污染物在20 ℃下，经过28 d后累计去除率仅为41%，同样天数，25 ℃下石油污染物的累计降解率达到5346%，25 ℃的实验效果要好于15 ℃和20 ℃的实验效果，20 ℃的实验效果要优于15 ℃的效果。
第二批次实验两种浓度在选择的4个温度中，30 ℃实验瓶中石油污染物的累计降解率达到70.87%和5819%，这比25 ℃和35 ℃情况下效果都好，说明30 ℃是本次所选菌剂最佳生长温度。在此温度下，去除石油污染物效果最佳。图1 第二次实验中石油污染物降解率在不用温度下随时间变化结果(862.5 mg/l)
fig 1 chang of degradation rates with time in oil contaminated
soils of different temperature(862.5 mg/l)
2.3 浓度对石油污染物去除率的影响
第二批次实验中设置了8625 mg/l和1 6950 mg/l两种浓度。从实验结果看，同等温度下，小浓度的实验瓶中石油污染物的累计去除率比大浓度的大。除30 ℃外，小浓度的其他温度实验瓶的石油污染物的去除率比大浓度的35 ℃的累计去除率都大。另外，第一次实验28 d后25 ℃实验瓶中的石油去除率为5346%，而第二次实验30 d后25 ℃实验瓶中的石油去除率为5259%。可见浓度对实验效果有很大影响。这是因为加入同等数量的菌剂，其可以消耗掉的石油污染物的的数量是相同的。
3 结论
利用优化土著微生物菌群的微生物技术，进行了华北地区石油污染地下水的微生物修复实验研究。在两次实验过程中，加入经过筛选放大培养的菌剂，分别经过28 d和37 d后，石油污染物累计去除率最大分别为5346%和7087%，说明本次所选菌剂对修复油污地下水具有明显效果。通过设置不同温度，可以得出30 ℃是该菌群的最佳生长温度，对油污地下水的效果最明显。另外，同等菌剂量的情况下，石油污染物的浓度越大其去除率越低。而无菌对照实验的石油含量变化在5%以内，说明在自然条件下地下水中石油降解较缓慢。
参考文献:
［1］ biodgett,w.c.&jr..water-soluble mutagen production during the bioremediation of oil contaminated soil［j］.fla.sci.,1997,60(1):28-36.
［2］ 王业耀,孟凡生.石油烃污染地下水原位修复技术研究进展［j］.化工环保,2005,25(2):117-120.（wang ye-yao,meng fan-sheng.development of in-situ remediation technology for petroleum hydrocarbon contaminated groundwater［j］.environmental protection of chemical industry,2005(2):117-120.(in chinese))
［3］ clark l.groudwater and subsurface remediation:research strategies for in situ technology［j］.journal of environmental pollution,1996,94:101-102.
［4］ younger p l.groundwater and subsurface remediation:research strategies for in situ technology［j］.journal of hydrology,1997,192:383-386
