3 结果与讨论
3.1 单因素实验
3.1.1 提取温度对葡萄皮花色苷提取的影响实验结果分析
在提取液乙醇浓度为 60%，提取液 ph 1.0 的条件下，于 30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下提取葡萄皮中的花色苷，结果见图3-1。
图 3-1 提取温度对葡萄皮花色苷提取的影响
从图3-1可以明显看出，提取温度在 30℃- 50℃时，葡萄皮花色苷的提取率受提取温度的影响不大。当提取温度上升到 50℃以后，随着提取温度的升高，葡萄皮花色苷的提取率有着较大的提高，当提取温度达到60℃时，花色苷的提取率达到最大，温度过高会对花色苷的稳定性产生影响，因此，提取温度为60℃时的提取效果最佳。
3.1.2 乙醇浓度对葡萄皮花色苷提取的影响实验结果分析
在温度60℃，提取液 ph 1.0 的条件下，分别用乙醇浓度为 0%、20%、40%、60%、80%、95%的酸性乙醇溶液来提取葡萄皮中的花色苷，结果见图3-2。
图 3-2乙醇浓度对葡萄皮花色苷提取的影响结果
从图3-2可以明显看出，提取液的乙醇浓度在0-80%之间时，花色苷的提取率随着提取液乙醇浓度的增大而提高，当乙醇浓度达到 80%时，花色苷的提取率达到最大。提取液乙醇浓度超过 80%以后，花色苷的提取率随着乙醇浓度的升高而有所降低。因此，提取液的乙醇浓度为80%时，花色苷的提取率最高。
3.1.3 ph 对葡萄皮花色苷提取的影响实验结果分析
在温度60℃，提取液的乙醇浓度在80%条件下，分别用 ph 为 3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5 的酸性乙醇溶液提取葡萄皮的花色苷，结果见图3-3。
图 3-3 ph 对葡萄皮花色苷提取的影响结果
从图3-3可以明显看出，花色苷的提取率随着提取液 ph增大而减小，ph 值越低提取率越高，说明提取液中较强的酸性有利于葡萄皮中花色苷物质的浸出。当提取液的 ph 为0.5 时，花色苷的提取率达到最高。因此，提取液 ph 为 0.5 时的提取效果最好。
3.2 正交实验
3.2.1 正交实验的结果及分析
根据提取温度、提取液乙醇浓度、提取液 ph 等单因素试验的结果，以提取温度、乙醇浓度、ph 值三个因素作为研究对象，分别设三个水平，按 l9 (33)正交表进行正交试验，以花色苷提取液吸光值为考察指标，选出葡萄皮花色苷的最佳提取条件。见表3-1 因素水平表。
表3-1 葡萄皮花色苷提取因素水平实验表
代号
a
b
c
水平
温度℃
ph
乙醇浓度%
1
2
3
50
60
70
0.5
1.0
1.5
60
80
95
试验安排中的各个因素是随机安排的，每一行为一个试验。试验结果及分析见表3-2 l9 (33)正交试验结果及分析。
表3-2 正交试验结果及直观分析表
试验号
a
b
c
吸光值
温度
ph
乙醇浓度
1
1
1
1
0.425
2
1
1
2
0.441
3
1
1
3
0.402
4
1
2
1
0.374
5
1
2
2
0.355
6
1
2
3
0.350
7
1
3
1
0.330
8
1
3
2
0.317
9
1
3
3
0.309
10
2
1
1
0.475
11
2
1
2
0.507
12
2
1
3
0.483
13
2
2
1
0.407
14
2
2
2
0.412
15
2
2
3
0.398
16
2
3
1
0.346
17
2
3
2
0.349
18
2
3
3
0.353
19
3
1
1
0.373
20
3
1
2
0.397
21
3
1
3
0.365
22
3
2
1
0.349
23
3
2
2
0.337
24
3
2
3
0.341
25
3
3
1
0.307
26
3
3
2
0.299
27
3
3
3
0.310
k1
3.304
3.868
3.386
t=10.152
k2
3.730
3.323
3.414
k3
3.118
2.920
3.311
k1
0.367
0.430
0.376
k 2
0.414
0.369
0.379
k 3
0.346
0.324
0.368
r
0.068
0.106
0.011
表3-2中k1行的数值，即依次为ka1、kb1、kc1表示为因素a在1水平时所对应od530值之和，即ka1= 0.425+ 0.441+ 0.402+ 0.374+ 0.355+ 0.350+ 0.330+ 0.317+ 0.309=3.304 。kb1、kc1同理。
表3-2中k2行的数值，即依次为ka2、kb2、kc2。kc2表示为因素a在2水平时所对应的od530值之和，即ka2= 0.457+ 0.507+ 0.483+ 0.407+ 0.412+ 0.398+ 0.346+ 0.349+ 0.353=3.730。kb2、kc2同理。
表3-2中k3行的数值，即依次为ka3、kb3、kc3。kc3表示为因素c在3水平时所对应的od530值之和，即ka3= 0.373+ 0.397+ 0.365+ 0.349+ 0.337+ 0.341+ 0.307+ 0.299+ 0.310=3.118。kb3、kc3同理。
表3-2中k1行的数值，即依次为ka1、kb1、kc1。ka1=ka1/9=3.304/9=0.367。kb1、kc1 同理，k2、k3行的数值所得的方法与k1同理。
表3-2中r行的数值，依次为ra、rb、rc。ra的数值是因素a列k的最大值减去k的最小值，即ra=kamax－kamin=0.414－0.346=0.068。rb、rc同理。
根据r值的大小来确定葡萄皮花色苷的提取温度、ph值、乙醇浓度这三个因素对于本试验的显著性。r值越大，则该因素显著性越大。根据表中r的值可确定以上三个因素的显著性是：b＞a＞c。
表3-2中三个因素的优水平的确定是以k值为依据。例如因素a列，k2＞k1＞k3,则因素a中2水平为优水平；又如因素b列，k1＞k2＞k3，则因素b中1水平为优水平。依次类推可得试验范围内的优水平为a2、b1、c2，即葡萄皮花色苷的提取温度为60℃、ph值为0.5、乙醇浓度为80%。
3.3 葡萄皮花色苷的稳定性研究
3.3.1 稳定剂的选取结果
取葡萄皮花色苷提取液稀释10倍，取四份样液，每份10ml，分别加入等量的0.02%的柠檬酸、l-谷氨酸、半胱氨酸、抗坏血酸溶液各10ml，在80℃的条件下恒温3h，每隔30 min取样一次，结果见图3-4。
图3-4 稳定剂的选取结果
从图3-4可以明显看出，加入稳定剂对葡萄皮花色苷的稳定性有一定效果，随着加热时间增加，吸光值不断的下降，而且可以看出柠檬酸下降的最慢，说明柠檬酸对葡萄皮花色苷的稳定性效果更好。
3.3.2 稳定剂用量的选取结果
对已选取的稳定剂进行用量试验，分别配置0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%的柠檬酸，在80℃的条件下恒温2h，每隔30 min取样一次，结果见图3-5。
图 3-5 柠檬酸的用量测定结果
从图3-5可以明显看出，0.02%柠檬酸的葡萄皮花色苷溶液下降趋势要比对0.04%柠檬酸的葡萄皮花色苷溶液下降趋势小，由于0.06%、0.08%、0.10%柠檬酸的葡萄皮花色苷溶液出现不等量的沉淀，故0.02%柠檬酸对葡萄皮花色苷溶液的稳定性效果更好。
3.3.3 温度对葡萄皮花色苷稳定性影响实验
取一定量葡萄皮花色苷提取液，用蒸馏水稀释10倍，分别加入等量的稳定剂分别置于70℃、80℃、90℃恒温下，每30 min测定溶液中花色苷的浓度，结果见图3-6。
图 3-6温度对葡萄皮花色苷稳定性影响结果
从图3-6可以明显看出，随着温度的提高和加热时间的延长，花色苷溶液的吸光度值变化明显，趋于减小，说明花色苷的耐热性差。在加入稳定剂柠檬酸后，则可以有效地提高花色苷对热的耐受性，其吸光度值均比对照变化小。故随着温度的升高花色苷降解速度加快，稳定性逐渐下降。
3.3.4 不同类型光照对葡萄皮花色苷稳定性影响实验
取葡萄皮花色苷提取液稀释20倍，分别加入等量的稳定剂分置于日光灯、自然光、避光条件下，每天定时测定溶液中花色苷的浓度，结果见图3-7。
图 3-7不同类型光照对葡萄皮花色苷稳定性影响结果
从图3-7可以明显看出，光照对花色苷的稳定性有较大影响。葡萄皮花色苷在避光保存时稳定性最好；在自然光条件下的葡萄皮花色苷降解速率最高。这是由于光照可以引起花色苷降解生成c4羟基的中间产物，该中间产物在c2位上水解生成查耳酮后进一步转变为2，4，6-三羟基苯甲醛以及取代的苯甲酸等产物，因此光也能促使花色苷降解褪色。
3.3.5 氧化剂对葡萄皮花色苷稳定性影响实验
取一定量葡萄皮花色苷提取液，用蒸馏水稀释10倍，分别加入h2o2，使含量分别达到0%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%，室温静置1h，结果见图3-8。
图3-8氧化剂对葡萄皮花色苷稳定性影响结果
从图3-8可以明显看出，h2o2对葡萄皮花色苷的稳定性有很大影响。随着h2o2浓度的升高，葡萄皮花色苷的稳定性也逐渐下降。在0.2%是影响最大。说明h2o2对葡萄皮花色苷的稳定性存在着很大的破坏作用，能促进葡萄皮花色苷的降解。这可能是因为h2o2可直接亲核进攻花色苷的c位，使花色苷开环生成查耳酮，查耳酮进一步降解生成各种无色的酯类物质和香兰素的衍生物，这些氧化产物或者进一步降解成小分子物质，或者相互之间发生聚合反应，从而导致花色苷的降解。
3.3.6 还原性物质对葡萄皮花色苷稳定性影响实验
取一定量葡萄皮花色苷提取液，用蒸馏水稀释10倍，分别加入不同质量的亚硫酸钠，使溶液中亚硫酸钠分别达到0、2.5×10-5 mol/l、5.0×10-5mol/l、7.5×10-5mol/l、10×10-5mol/l，室温静置1h，结果见图3-9。
图 3-9还原性物质对葡萄皮花色苷稳定性影响结果
从图3-9可以明显看出，亚硫酸钠对葡萄皮花色苷的稳定性有一定影响。随着na2so3浓度的升高，葡萄皮花色苷的稳定性也逐渐下降。说明低浓度的亚硫酸钠对葡萄皮花色苷的稳定性没有太大影响，而高浓度的亚硫酸钠会在一定程度上加速葡萄皮花色苷的降解。
3.3.7 食品防腐剂对葡萄皮花色苷稳定性影响实验
取一定量葡萄皮花色苷提取液，用蒸馏水稀释10倍，分别加入不同质量的苯甲酸钠，使溶液中苯甲酸钠的含量分别达到0%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%，室温静置1h，结果见图3-10。
图 3-10食品防腐剂对葡萄皮花色苷稳定性影响结果
从图3-10可以明显看出，苯甲酸钠这种常用的食品防腐剂对葡萄皮花色苷的稳定性并无较大影响。随着苯甲酸钠含量的提高，花色苷的吸光值呈递减趋势，但是溶液的颜色变化不大。
3.3.8 糖对葡萄皮花色苷稳定性影响实验
取一定量葡萄皮花色苷提取液，用蒸馏水稀释10倍，分别加入不同质量的蔗糖，使溶液中蔗糖含量分别达到 0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，室温静置1h，结果见图3-11。
图 3-11糖对葡萄皮花色苷稳定性影响结果
从图3-11可以明显看出，蔗糖对葡萄皮花色苷的稳定性无较大影响。当蔗糖浓度在0%～2.0%范围内，随着浓度的增大，花色苷的吸光值呈递减趋势，但是溶液的色泽无明显变化。
结 论
本课题以葡萄皮为原料，采用单因素轮换实验和正交试验相结合的方法研究不同因素即温度、ph值、乙醇浓度对葡萄皮花色苷提取的影响，同时对葡萄皮花色苷在不同条件下的稳定性进行研究，测定温度、光照、蔗糖、防腐剂、还原性物质、氧化性物质对葡萄皮花色苷的稳定性的影响。得到以下结论：
超声波辅助提取葡萄皮中花色苷的单因素试验和正交试验表明，在提取温度为60℃，提取液的乙醇浓度为80%，提取液ph为0.5的条件下,用超声波辅助法提取葡萄皮中花色苷的提取效果最好；在正交试验设定的水平范围内，提取液 ph 值对花色苷提取率有显著性影响。
葡萄皮花色苷的稳定性实验表明，温度和光照对葡萄皮花色苷的稳定性有很大影响。在低温条件下溶液中的葡萄皮花色苷较为稳定，热降解速度较慢，随着温度的升高葡萄皮花色苷降解速度加快，稳定性逐渐下降。在同一温度下，葡萄皮花色苷在避光保存时稳定性最好，而当葡萄皮花色苷溶液处于自然光照射条件下时，葡萄皮花色苷降解速率最高。蔗糖、防腐剂苯钾酸钠对葡萄皮花色苷的稳定性无明显影响。亚硫酸钠这类还原物质对葡萄皮花色苷的稳定性有一定影响，但不是很明显。h2o2对葡萄皮花色苷的稳定性有很大影响，能促进葡萄皮花色苷的降解。
参考文献
1 p.bridle,c.f. timberlake. anthocyanins as natural food colours-selected aspects[j]. foodchenmistry ,1997,58:103~109
2 mann j. secondary metabolism[m]. london:oxford univ. press,1987. 275~285.
3 bell charwood. secondary plant products[j]. encyclopedia of plantphysiology,1980,8(1):340—349.
4 reinert,yeoman. plant cell and tissue culture[m]. springer verlag,1982.48~49.
5 j b harborne. the chromatographic identification of anthocyanin pigments[j]. journal of chromatography,1958 ,1:473 ~488
6 yoshimoto m, okuno s, yoshinaga m, et al. antimutagenicity of sweet potato (ipomoea batatas)roots [j]. bioscience-biotechnology and biochemistry.1999,63(3):537~541
7 suda i, oki t, masuda m, et al. direct absorption of acylated anthocyanin in purple-fleshed sweetpotato into rats [j].journal of agricultureand food chemistry. 2002,50(6):1672~1676
8 高锦明主编,植物化学[m]. 北京:科学出版社 ,2003:156-164
9 刘邻渭主编,食品化学[m]. 北京:科学出版社 ,2003:156-164
10 丁锐.国外花色素苷的研究现状与进展[j].汉中师范学院学报(自然科学),2002(2),22:73-79
11 任雁,张惟广.花色素苷的研究进展[j]. 中国食品添加剂，2006（4）：71-77
12 庞志申.花色苷研究概况[j].北京农业科学,2000,18(5):37~42
13 卢钰,董现义,杜景平.花色苷研究进展[j].山东农业大学学报(自然科学版),2004,35(2): 315~320
14 温普红,王晓玲,杨得锁.葡萄籽中花色素的分离研究[j].精细化工,2001,18(4):218~219
15 邓军哲,屈慧鸽.葡萄花色素的研究概况[j].葡萄栽培与酿酒,1996,(2):25~27
16 段长青,贺普超,康靖全.中国葡萄野生种花色素双糖苷的研究[j].西北农业大学学报,1997,25(5):23~28
17 唐传核,彭志英.天然花色苷类色素的生理功能及应用前景[j].食品添加剂,2000(1):26~28
18 唐传核,杨晓泉.葡萄及葡萄酒生理活性物质的研究概况(ⅰ)生理活性物质[j].
中国食品添加剂,2003(1):41~48
19 韩富亮.葡萄与葡萄酒花色素苷 hplc 指纹图谱的初步研究[.硕士论文,2004
20 任玉林,李华,邴贵德等.天然食用色素-花色苷[j].食品科学,1995,16(7):22~27
21 高爱红,童华荣.天然食用色素—花青素研究进展[j].保鲜与加工,2001,(3):25~27
22 郭金耀,杨晓铃.葡萄皮色素的提取及其性能研究[j].山西农业大学学报,1994,14(4):415~418
23 杨贤松,杨占苗,高峰. 紫色甘薯色素的研究进展[j].食品科学,2006,22(4):94~98
24 邓洁红,谭兴和,潘小红等.葡萄花色苷研究进展[j].2006,24(6):22~28
25 董爱文,向中,李立君等.爬山虎红色素的定性定量分析[j].无锡轻工大学学报,2003,22(6):99~102
26 张昭其,庞学群,段学武等.荔枝果皮褐变过程中花色素苷含量的变化及测定[j]. 华南农业大学学报.2003,23(1):16~19
27 冯建光,谷文英.葡萄皮红色素的示差法测定[j]. 分析检测,2002,23(9):84~86
28 黄舫，李汴生，徐志宏，张名位，池建伟.黑豆种皮色素的测定和提取[j]. 食品工业科技，2004，25（4）：117~122
29 秦含章.葡萄酒分析化学[m].北京:中国轻工业出版社.1991
30 马海燕,张振文,汪成东.葡萄皮花色素不同提取方法的比较研究[j].酿酒科技,2005(5) :81~84
31 王萍,苗雨.酶法提取黑加仑果渣花色苷的研究[j].林产化学与工业,2008,28(1):113~118
32 彭雪萍,马庆一,王花俊等.超高压提取苹果多酚的工艺研究[j].食品科技,2008(3):157~159
33 陈 瑞 战 , 张 守 勤 , 刘 志 强 . 超高 压 技 术 在 中 药 有 效 成 分 提 取 中 的 应 用 [j]. 中草药,2007,38(12):1095~1098
34 任玉林,李华,邴贵德等.天然食用色素-花色苷[j].食品科学,1995,16(7):22~27
