作者：代长云 黄海军 向敏 陶弼菲 陈志华 高其双 吴建英

　　摘要介绍了动物乳腺生物反应器的概念,综述了动物乳腺生物反应器及其载体的发展现状,以为动物乳腺生物反应器进一步研究提供借鉴。
　　关键词动物乳腺生物反应器;表达载体;发展现状
　　
　　1动物乳腺生物反应器的概念
　　动物乳腺生物反应器(mammary gland bioreactor)属于转基因动物范畴,其原理是通过转基因技术,将乳腺组织特异性启动子驱动的外源基因,在动物乳腺组织高效表达,通过乳汁分泌到体外,该方式不会对动物自身机体造成损害,通过回收乳汁就可以提取有重要价值的生物活性蛋白。通常情况下,这种外源蛋白的特异性表达方式更安全、可靠。
　　2动物乳腺生物反应器表达载体的发展
　　外源基因在动物乳腺中高效表达有2个前提:一是选用的调控元件要能指导目的基因在乳腺中高效、特异性表达,并且表达产物能分泌到乳汁中;二是整合到动物染色体基因组中的表达载体要处于开放和活跃转录状态,而这2个前提都归结于表达载体的成功构建[1]。
　　2.1基于普通质粒的表达载体
　　哺乳动物的染色体是由许多独立、分散的区域组成,区域内含有单个或多个转录单元,包括调控基因表达的所有控制元件。乳蛋白基因以独立区域的形式存在于染色体上。对乳蛋白区域进行调控的一些重要控制元件可分为三类:①调控基因转录的元件,包括启动子、增强子和激素应答元件。乳蛋白的启动子和增强子在大多数情况下位于转录起始位点数百个碱基处的5’侧翼区,有时可远至10kb。乳蛋白激素应答区的表达受催乳素、胰岛素、糖皮质激素及细胞间质的诱导。②具有使染色体变构和开放功能的元件,有位点控制区和核基质黏附区,主要用于对抗位点效应。位点控制区位于5’远端,是大区域的dnasei高敏区。位点控制区包括多个dnasei高敏区,各个高敏区与其反式因子结合成一个单元,然后对启动子复合物起作用。因此,一般认为位点控制区具有增强子和绝缘子的双重功效[2]。核基质黏附区也起到绝缘子的作用,并且还具有转录增强活性,多数位于区域的两端,可以把区域拴在核基质上。③与转录后翻译有关的元件,主要包括5’和3’非翻译区及poly a位点。它们主要影响mrna的加工过程、翻译效率和稳定性[1]。这种载体使用的一般是cdna,因而有可能丢失一些增强表达的元件,转录后的mrna也不稳定。另外,这种载体的容量较小,不可能包含整个乳蛋白基因座,往往不含位点控制区和核基质黏附区等序列,因而易受整合位点邻近基因簇序列的影响,出现表达沉默或异位表达的情况,即“位点效应”。
　　用普通质粒的表达载体制备乳腺生物反应器的研究中,外源蛋白高水平表达的报道较少,绝大多数研究中只能达到微克级甚至纳克级。但是,由于其操作技术成熟,成本较低,仍被广泛应用于转基因动物模型的研究。
　　2.2基于酵母人工染色体的表达载体
　　为了保持表达调控序列的天然状态,最好将包含所有调控序列的乳蛋白基因座组装到一个载体中,这样就可以克服位点效应的影响,实现位点独立性表达,这就需要大容量的载体,如酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,yac)。yac由着丝粒、端粒和复制原点三大要素构成,第1个yac于1983年创建[3]。利用yac制备转基因动物乳腺生物反应器一般有2种方法:es细胞转染法和显微注射法。前者是用脂质体将yac转入es细胞,利用yac左臂上的neo标记基因来筛选整合yac的es细胞,再经由胚胎注射形成嵌合体。其缺点是难以得到完整yac插入的动物,如jakobovits等[4]所制备的yac转基因小鼠必须通过选种选配,将2个半合子转基因小鼠成功交配,才能得到纯合子转基因小鼠;后者是将yac注入受精卵的原核,该方法可以得到yac完整插入的转基因动物,但显微注射操作比较困难,容易对yac造成损伤[5]。虽然2种方法均可以生产yac转基因动物,但是如何纯化完整的yac,制备携带完整yac的转基因动物,仍然是一个亟待解决的难题。
　　2.3基于同源重组的定点打靶载体
　　除同源重组技术外,无论采用何种技术导入外源基因,外源基因均是随机插入受体细胞基因组的任何位置。利用同源重组原理的基因打靶技术的出现,能够将目的基因定位整合于乳蛋白(或其他合适的)基因座,充分利用天然乳蛋白固有的高效表达调控机制,克服拷贝数依赖性和随机整合的“位点效应”,保证目的基因在乳腺中的特异性表达,并可能取得与乳蛋白同步的表达水平。如将携带启动子的外源基因敲入一些开放的活跃转录的位点中(如hprt位点)可以克服“位点效应”的影响[6]。
　　乳腺生物反应器的基本原理是用乳蛋白基因启动子和调控区指导外源基因在乳腺中特异性表达。常用的乳蛋白有乳清酸性蛋白(whey acidic protein,wap)、α-乳蛋白、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,blg)、β-酪蛋白和αsl-酪蛋白等。其中,blg是牛、羊等反刍动物乳汁中含量最高的乳清蛋白,说明驱动其表达的启动子效率较高。在目前有关乳腺生物反应器的研究报道中,以blg基因调控序列指导人α-1-抗胰蛋白酶基因在绵羊乳腺中的表达水平最高,达到35g/l。此外,blg基因调控区相对较短,大部分乳腺特异性表达调控元件位于-406bp范围内[7],易于进行分子克隆。因此,blg基因调控序列是构建反刍动物乳腺特异表达载体的首选调控序列。
　　3动物乳腺生物反应器的发展现状
　　全球已经有几十家大公司在进行动物乳腺生物反应器的产业化开发。其中英国的ppl公司、荷兰的pharming以及美国最大的生物技术公司genzyme transgenics corporation是3个最为出色的公司。他们在药物开发、市场和产业化方面投入大量资金。到目前为止,已有2种药物完成临床试验(其中重组人抗凝血酶ⅲ(atryn®)已于2006年批准上市),5种进入临床ⅲ期试验,37种进入ⅱ期临床研究阶段。现在,许多国家正在进行相应的工作,如美国、英国、俄罗斯、瑞典、荷兰、澳大利亚、加拿大、法国等。在国内,早在1983年,施履吉院士就提出利用转基因动物乳腺生产重组蛋白质的构想。与国外相比,中国在转基因动物乳腺生物反应器研究方面比较落后。但是,国家“863”计划已经将乳腺生物反应器的研究作为重大项目进行资助,将使中国转基因动物乳腺生物反应器的研究和开发进入一个蓬勃发展的新时期,目前已经取得一些重要成果[8-10]。
　　尽管动物乳腺生物反应器的研究和发展很快,但仍面临一些问题,诸如生产周期长、基因整合效率不高等。此外,转基因动物死亡率较高,常出现不育导致转基因动物续代难,从而无法大规模生产。纵观全球,外源基因能够在大动物乳汁中高效表达的成功实例很少,真正达到产业化生产标准的更是屈指可数。
　　动物乳腺生物反应器研究的现状,特别是奶用家畜乳腺生物反应器的研究现状,可以用“难度大、效率低、时间长和费用高”来形容。其中,生产转基因动物效率低和外源基因表达受“位置效应”的瓶颈影响最为严重,是构建动物乳腺生物反应器必须克服的最大难题。克隆技术可以将体外培养的、基因定点修饰后的动物体细胞(或者干细胞)转变成动物个体,从而可以很好地解决动物转基因表达效率低的问题。因此,采用以体细胞克隆技术和转基因干细胞技术为核心的各种技术平台,可能是未来生产动物乳腺生物反应器动物的希望和必然趋势。目前,在这方面已有成功的报道[10,11]。21世纪,转基因干细胞技术和动物克隆技术的有机结合,必将实现种质创新和技术突破。乳腺生物反应器的产品将大量进入市场,为人类的生存与健康发展作出贡献。

　　4参考文献
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　　[3] murray a w,szostak j w.construction of artificial chromosomes in yeast[j].nature,1983(305):189-193.
　　[4] jakobovits a,moore a l,green l l,et al.germ-line transmi-ssion and expression of a human-derived yeast artifical chromosome[j].nature,1993(362):255-258.
　　[5] strauss w m,dausman j,beard c,et al.germ line transmission of a yeast artificial chromosome spanning the murine alpha 1(i)collagen locus[j].science,1993(259):1904-1907.
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　　[7] whitelaw c b,harris s,mcclenaghan m,et al.position- inde-pendent expression of the ovine laetoglobulin gene in transgenic mice[j].biochem j,1992(286):3l-39.
　　[8] 黄淑帧,陈美珏,黄英,等.乳汁中分泌有活性的人凝血因子ⅸ的转基因羊的研制[j].科学通报,1998(7):112-113.
　　[9] 吴应积,张学明,杨东山,等.药用蛋白质乳腺生物反应器的制作技术及新方法进展[j].生物技术通报,2009(z1):54-59.
　　[10] yang p,wang j,gong g,et al.cattle mammary bioreactor generated by a novel procedure of transgenic cloning for large-scale production of functional human lactoferrin[j].plos one,2008(3):3453.
　　[11] giuili g,tomljenovic a,labrecque n,et al.murine spermato-gonial stem cells:targeted transgene expression and purification in an active state[j].embo rep,2002(3):753-759.