目录
目录. i
摘要. i
abstract ii
1 前言. 1
2材料与方法. 2
2.1材料.
2.1.1 急性毒性实验.
2.1.2 新阿维菌素制剂对大中华鳋的杀灭效果的观察.
2.2方法. 3
2.2.1 急性毒性实验. 5
2.2.2 新阿维菌素制剂对大中华鳋的杀灭效果的观察. 5
3结果与分析. 6
3.1 急性毒性试验结果与分析. 6
3.2 新阿维菌素制剂草鱼鱼鳃上寄生的大中华鳋杀灭观察结果与分析. 7
4讨论. 10
参考 文献 . 12
致谢. 13
摘要
目的主要研究 草鱼中寄生的大 中华鳋 的药物防治，对新阿维菌素制剂杀灭 大 中华鳋 进行安全性和疗效评价。 水产受试药物对 黄颡鱼、大口鲶、 白鲢的急性毒性实验研究结果表明黄颡鱼安全浓度（ sc ）为 0.0842mg/l ， 大口鲶安全浓度为 0.2163 mg/l ，白鲢安全浓度为 0.2304 mg/l 。因为黄颡鱼的安全浓度范围较低，故在一个池塘中施药时可以以其做依据。在安全浓度下该药对离体大 中华鳋 的杀灭效果较为显著，大多数死亡，而在高浓度条件下，虽可有效杀灭大中华鳋，但此时对鱼体亦有较大影响。因此具体应用到生产上，有必要进行进一步的研究，从而合理开发使用药物。
关键词
阿维菌素制剂；安全浓度；大 中华鳋
abstract
the research aims at studying the treatment of sinergasilus , and evaluating the effect and safety of avermectin preparation on grass carp . drugs testes on pelteobagrus fulvidraco ， silums meridionlis , hypophthalmichthys molitrix in the acute toxicity shows that the sc for pelteobagrus fulvidraco is 0.0842mg/l,and for silums meridionlis is 0.2163 mg/l,and hypophthalmichthys molitrix is 0.2304 mg/l. as the safe concentration for pelteobagrus fulvidraco is low, so it can be a basis. under the safe concentration the killing effect of avermectin is just good, most of them are dead. at sc conditions although it could kill sinergasilus effectively but have a greater bad impact on fishes. therefore, further studies are necessary for the specific application to the production. so the development of drug use must on the way.
keywords
avermectin ； safe concentration ； sinergasilus ；
1 前言
中华鳋病的病原体有大中鳋和鲢中华鳋。中华鳋雌雄异体，雌虫营寄生生活，雄虫营自由生活。大中华鳋的雌虫寄生在草鱼鳃上，鲢中华鳋寄生在鲢鳃上。雌虫用大钩钩在鱼的鳃丝上，像挂着许多小蛆，所以中华鳋病又叫 “ 鳃蛆病 ” 。中华鳋寄生在鱼的鳃上，除了它的大钩钩破鳃组织，夺取鱼的营养以外，它还可能分泌一种酶的物质，刺激鳃组织，使组织增生，病鱼的鳃丝末端肿胀发白、变形，严重时，整个鳃丝肿大发白，甚至溃烂，使鱼死亡。每年 5 ～ 9 月为流行盛期（ 刘国勇 等， 2008 ）。 大中华鳋主要危害 2 龄以上的草鱼 ，病鱼在水中跳跃不安，食欲减退或不食，体发黑；严重时或并发其它病时，呼吸困难，离群独游，或停留近岸水体中，不久死亡。揭开鳃盖，可见许多带有卵囊的雌鳋挂在肿胀发白的鳃丝末端上，形似白色小蛆。目前对 大中华鳋 病的 治疗 还没有特效方法， 大中华鳋 病一旦发生，就难以控制，常常造成水产养殖业巨大的 经济 损失。
阿维菌素为一种触杀，胃毒，渗透力强的鱼病药物。它是一种大环内酯双糖类化合物。是从土壤微生物中分离的天然产物。但它对叶片有很强的渗透作用，可杀死表皮下的害虫，且残效期长，它不杀卵（ suzuki k et.al,1999) 。它属于新型广谱、高效、低毒抗生素类抗寄生虫药，对体内外寄生虫特别是线虫和节肢动物均有良好效果。本品对害虫的驱杀作用，在于增加虫体的抑制性递质 r- 氨基丁酸（ gaba ）的释放 , 以及打开谷氨酸控制的氯通道，增强神经膜对氯的通透性，从而阻断神经信号的传递，最终神经麻痹，使肌肉细胞失去收缩能力，从而导致虫体死亡。
阿维菌素是由日本北里大学大村智等和美国 merck 公司在 1979 年首先开发的一类具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的十六元大环内酯化合物，由链霉菌中灰色链霉菌发酵产生。原药为白色或黄白色结晶粉，有效成分含量 75%-80% ，常温下不易分解，在 25 ℃ 、 ph6-9 的溶液中无分解现象。主要 通过胃毒和触杀作用来杀灭害虫。阿维菌素对害虫、害螨的药效虽不如有些神经毒剂那么快，但它能麻痹害虫，使之极少取食，达到使作物免遭虫害的目的（ 王广成等， 2006 ）。就其生产现状而言阿维菌素价格自 2001 年以后波动幅度较大。 2009 年阿维菌素价格上涨，阿维菌素油膏市场价从 2008 年 12 月份的 700 元／ kg 到 2009 年 5 月的 1050 元／ kg ，上涨了 50 ％左右。目前 中国 阿维菌素产能近 2500 t ／年，实际产量在 1800t 左右。自 2003 年以来年需求增幅为 50 ％。预计 2009 年年需求量在 2300t 左右，实际生产产量在 1800t 左右， 500t 供求缺口要靠价格上涨抑制。随着阿维菌素价格上涨，众多生产 企业 有新增和扩建的迹象，阿维菌素又将迎来一波大幅度的 扩产潮。预计到 2010 年 6 月份阿维菌素原药产能将达到 6000t 以上，出现供大于求的局面。 2010 年阿维菌素的市场需求量 预计 2500 ～ 2800t 之间。阿维菌素原药有望在 2010 年的下半年再次创出 600 元／ k g 以下的新低价，并在较长的一段时间内维持较低的价格。预计阿维菌素原药在近几年还会出现一次供不应求局面，之后国内外市场将全面进入成熟期，原药价格将趋于平稳（孙娟，孟水强， 2009 ）。
草鱼（ ctenopharyngodon idellus ）属 鲤形目 鲤科 雅罗鱼亚科草鱼属，栖息于平原地区的江河湖泊，一般喜居于水的中下层和近岸多水草区域。草鱼性活泼，游泳迅速，常成群觅食，为典型的草食性 鱼类 。因其生长迅速，饲料来源广，是中国 淡水养殖 的四大家鱼之一。而其培养过程中会感染大中华鳋病等，本实验主要研究阿维菌素对寄生于鱼体的大中华鳋的杀灭作用，并预先测出对鱼类本身的安全浓度，以便于在鱼体安全浓度下用药并证明最终查杀效果。
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 急性毒性实验
实验鱼为孵化一周的鱼苗，由武汉市东西湖水产繁育基地提供，平均全长为 1.47±0.20 cm ，平均体重 22.75 mg 。实验药物为北京清海洋科技有限公司产品。 实验容器为规格 30 × 30 × 50 cm 的玻璃水族箱。试验用水为充分曝气后的自来水，水温 25.00 ± 1 ℃ ， ph 为 6.70~7.00 ，溶氧为 5.00~7.50 mg/l 。
玻璃缸或白色泡沫箱： 15 个，规格 30 × 30 × 50 cm ，水族箱： 1 个，用于暂养
实验药物：阿维菌素制剂
器材：解剖剪、镊子、解剖针、标签纸、量筒（ 10 、 100 、 1000 ml ）、包埋器、烧杯（ 250 ml ）、解剖盘
2.1.2 阿维菌素制剂 对 大中华鳋的杀灭效果的观察
实验鱼为鱼池养殖的团头鲂、黄颡鱼和白鲢。
试验药物：阿维菌素制剂，生理盐水，
器材：光学显微镜，六孔板，量筒，烧杯，盖玻片，载玻片，镊子，水族箱，
2.2 方法
2.2.1 急性毒性实验
急性毒性试验（ acute toxicity test ）：是指在短时间内（通常为 24 ～ 96 h ）让试验生物接触高浓度有毒物质，被测试有毒物质引起生物群体产生特定百分数有害影响的试验。在急性毒性试验中，由于生物的死亡容易观察，并且又是最严重而明显的有害影响，因此，特定时间内试验生物的死亡率经常被用作急性毒性试验的描述指标。
实验分四步：
第一步：预实验确定 24 h 鱼苗全部存活的药物最高浓度和鱼苗全部死亡的最低浓度。
第二步：设置若干浓度梯度，每浓度设三个平行组。
第三步：统计各梯度 24 h 、 48 h 、 72 h 和 96 h 平均死亡率，观察中毒和死亡个体的症状。
第四步： 计算 24 h 、 48 h 和 96 h 的 lc 50 ，并根据相关公式计算受试物的安全浓度。
实 验结果取重复组的平均值，死亡率 p 的计算公式为（ p 1 － c ） / （ 1 － c ），其中 p 1 为观察死亡百分数， c 为对照组死亡百分数。采用 sas8.1 软件以浓度的常用对数为横坐标，死亡率的概率单位为纵坐标进行统计处理，拟合回归方程，用 f 检验法检验回归方程的显著性。根据死亡率、死亡时间及相应的药物浓度采用半对数直线内插法求出 24 h 、 48 h 和 96 h 的 lc 50 及 95 ％可信限。
安全浓度（ sc ）是指对试验动物完全生命周期都无有害影响的毒物浓度。
其计算公式如下
经验公式：安全浓度＝ 96h lc 50 × 0.1
tumbell 公式： sc ＝ 48h lc 50 × 0.3 / （ 24h lc 50 / 48h lc 50 ） 2 （张金彪等， 2009 周剑等， 2009 ）。
半致死浓度（ lc 50 ）是指：一定条件下，某药物能引起试验生物群体中半数个体死亡的剂量。其测量暂没有统一标准。
2.2.2 阿维菌素制剂对 大 中华鳋 的杀灭效果的观察
杀灭 大 中华鳋 的标准： 在显微镜下观察大 中华鳋 ， 虫体在 1 到 2 分钟内消化系统运动减缓或停止。 设 蒸馏水为对照组，药物浓度 设 安全浓度组、二分之一安全浓度组、十分之一安全浓度组、两倍安全浓度组以及十倍安全浓度组。
（ 1 ） 观察不同浓度的新 阿维菌素制剂 对离体 大 中华鳋 的杀灭效果
用镊子夹取鱼的鳃部到蘸有蒸馏水的载玻片上，取收集显微镜视野下可见的大 中华鳋 ，置于对照组蒸馏水和不同浓度药液中， 10 min 、 1 h 、 2 h 、 6 h 、 12 h 、 24 h 后显微镜下观察，记录成熟期大 中华鳋 存活 情况。
（ 2 ） 观察不同温度下的新 阿维菌素制剂 对离体 大 中华鳋 的杀灭效果
夹取鱼鳃于蘸有蒸馏水的载玻片上，取收集显微镜视野下可见的大 中华鳋 ，置于对照组蒸馏水和不同温度下的药液中， 10 min 、 1 h 、 2 h 、 6 h 、 12 h 、 24 h 后显微镜下观察，记录成熟期大 中华鳋 存活 情况
3 结果与分析
3.1 急性毒性试验结果与分析
注：
黄颡鱼平均体长和平均体重为 1.1000 cm,0.0502 g
本实验由于 24 h 和 48 h 时的半致死浓度差别较大，因而采用安全浓度（ sc ）的计算公式为 tumbell 公式： sc ＝ 48 h lc 50 ×0.3 / （ 24 h lc 50 / 48 h lc 50 ） 2 。
半致死浓度（ lc 50 ）是指：一定条件下，某药物能引起试验生物群体中半数个体死亡的剂量。
通过实验，得到阿维菌素对黄颡鱼的安全浓度（ sc ）为 0.0842 mg/l ，对 大口鲶 的安全浓度为 0.2163 mg/l ，对白鲢的安全浓度为 0.2304 mg/l 。可以得知，鱼类对阿维菌素制剂比较敏感，而黄颡鱼的安全浓度最低，并以其为标准依据来对池塘进行用药。
3.2 新 阿维菌素制剂对草鱼鱼鳃上寄生的 大 中华鳋 杀灭观察结果与分析
表 3-3 水温 20℃ 下不同浓度阿维菌素对离体大 中华鳋 的作用效果
table 3-3 effect of different concentration of avermectin on sinergasilus at 20 ℃
时间 time 成活率
浓度
concentration
10min
1h
2h
6h
12h
24h
0.008 mg/l
100%
100%
100%
90%
90%
90%
0.040 mg/l
100%
100%
90%
90%
90%
90%
0.080 mg/l
100%
90%
80%
80%
70%
70%
0.160 mg/l
70%
40%
20%
10%
5%
0%
0.800 mg/l
10%
5%
5%
0%
0%
0%
对照组
control group
100%
100%
100%
100%
100%
100%
表 3-4 水温 23℃ 下不同浓度阿维菌素对离体大 中华鳋 的作用效果
table 3-4 effect of the different concentration of avermectin on sinergasilus at 23 ℃
时间 time
浓度 存活率
concentration
10 min
1h
2h
6h
12h
24h
0.008 mg/l
100%
100%
100%
90%
90%
90%
0.040 mg/l
100%
100%
90%
90%
90%
90%
0.080 mg/l
100%
90%
90%
80%
80%
80%
0.160 mg/l
80%
50%
30%
10%
5%
5%
0.800 mg/l
20%
5%
5%
0%
0%
0%
对照组
control group
100%
100%
100%
100%
100%
100%
在一个池塘里，放养鱼类为了符合生态系统的标准一般较多样，在测定安全浓度时应考虑所有鱼中能承受的最低安全浓度，在 24 h 、 48 h 和 96 h 的 lc 50 中黄颡鱼、大口鲶、白鲢依次增大，因而取黄颡鱼的 lc 50 为上限，在低于黄颡鱼 48 h 时的半致死浓度 0.4373 mg/l 时均可行。而黄颡鱼的 48 h 安全浓度为 0.0842 mg/l ，为较低者，因此以其为依据进行整体用药。
根据表 3 和表 4 可以发现十分之一安全浓度下的杀灭效果和对照组没有区别，二分之一安全浓度下对鱼的杀灭也不明显，安全浓度下杀虫率也不及百分之三十。两倍和十倍安全浓度下，作用比较明显，浓度越大，效应时间越短。
温度的不同，阿维菌素对大 中华鳋 的作用效果也是不同的。在一定程度上，温度高，成虫活性越明显。从而可以存活时间相对长一些。而温度低，成虫活性不明显，从而存活时间比温度高时短。另外从药动学方面看，推测温度变高时，阿维菌素药效降低，从而相同时间内杀灭效果降低。 当温度较高时，大中华鳋体内酶活性在一定程度上升高，对药物抵抗力也同时升高，因而药效降低。
4 讨论
通过观察表 3-2 阿维菌素对黄颡鱼 、大口鲶、 白鲢急性毒性试验特征分析本实验中阿维菌素染毒 24 h 、 48 h 、 72 h 和 96 h 时黄颡鱼的 lc 50 分别为 0.5457 、 0.4373 、 0.3838 mg/l ，大口鲶的 lc 50 分别为 0.9829 、 0.8864 、 0.7601 mg/l ，白鲢的 lc 50 分别为 0.9836 、 0.9058 、 0.8880 mg/l 。故黄颡鱼的黄颡鱼的半致死量浓度最低，因而对于一个池塘以其为施药依据。而经查阅相关资料得知阿维菌素染毒 24 h 、 48 h 、 72 h 和 96 h 时异育银鲫鱼种的 lc 50 分别为 0.21 、 0.14 、 0.08 、 0.06 mg/l ， sc 为 0.006 mg/l （王锡珍和陆宏达， 2009 ）。对比结果显示对异育银鲫鱼在 48 h 内的半致死浓度较低，因而在对池塘用药时要多加考虑对异育银鲫的影响。经查阅得知 阿维菌素对异育银鲫鱼苗和鱼种 、 食蚊鱼 、 鲢鱼苗 、 青虾 、 幼蟹 、 圆田螺 96 h 的 lc 50 分别为 0.018 、 0.06 、 0.08 、 0.02 、 0.52 、 0.25 、 0.57 mg/l ，安全浓度分别为 0.001 8 、 0.006 、 0.008 、 0.002 、 0.052 、 0.025 、 0.057 mg/l （ 王锡珍，陆宏达， 2009 ）。可知阿维菌素对体积较小型动物毒害较大，因而用药时还要多加考量一个池塘的其他物种。
本实验由于 24h 和 48h 时的半致死浓度差别较大，因而采用安全浓度（ sc ）的 计算 公式为 tumbell 公式： sc ＝ 48 h lc 50 ×0.3 / （ 24 h lc 50 / 48 h lc 50 ） 2 。
根据安全浓度 公式： sc ＝ 48 h lc 50 × 0.3 / （ 24 h lc 50 / 48 h lc 50 ） 2 得出在 24 h 、 48 h 和 96 h 的 lc 50 中黄颡鱼、大口鲶、白鲢依次增大，因而取黄颡鱼的 lc 50 为上限，在低于黄颡鱼 48 h 时的半致死浓度 0.4373 mg/l 时均可行。而黄颡鱼的 48 h 安全浓度为 0.0842 mg/l ，为较低者，因此以其为依据进行整体用药。
本实验的不足之处在于有关阿维菌素制剂的开发和应用目前还不够深入，缺乏毒 理学 和 治疗 方面的研究，而针对大 中华鳋 这种特定病原的研究相对更少。并且试验中用新阿维菌素制剂，讨论药效，仅探讨了其对死亡率的影响，并没有涉及到对疗效的影响。同时，阿维菌素的药物动力学和药物代谢研究也不多。药物体外杀虫只是水产药物评价和筛选的一个方面，其结果和数据的 参考 价值是有限的。并且有关大 中华鳋 具体种属的问题也没深入研究，只是观察了大 中华鳋 。另外，实验室试验忽略了外界环境的干扰，试验得出的数据与实际生产中的情况有相当的差异，这要求我们以后的试验尽量模拟生产条件，并做好病鱼治疗试验，以求更加贴近生产实际。
与此同时 在实验过程中也发现一些问题，比如新的阿维菌素制剂在强光下易分解失效，不能有效杀灭大中华鳋，所以在配置药液时需在光线比较温和，没有太阳光直射的情况下进行。并且新配置的药液不可放置太远，否则会失去药效，条件许可时，应做到现配现用。
现在随着高毒渔药的全面的被禁止使用，再加上我国正在逐步加大对渔业病虫害防治投入的力度，因为阿维菌素这种高效低毒生物杀虫剂具有对 人畜安全，对作物害虫杀灭效果好，不易产生抗药性等特点。因此研究其在水产方面是否也具有高效、低毒、杀灭效果好等特点具有十分广阔的应用前景。本研究通过研究草鱼大中华鳋病的治疗，对常用鱼类大中华鳋病防治药物进行了初步评价，为筛选效果良好而又安全的防治药物给予参考。通过治疗对新的阿维菌素制剂进行评价和研究，希望得出的试验数据可以为阿维菌素合理使用提供帮助。从而为鱼类大中华鳋病的防治方法和药物选择提供参考。
近年研发了一系列含阿维菌素的混合杀虫剂，如与各种菊酯类药剂混用，与毒死蜱混用等等，往往能够起到加速害虫死亡速度；增加触杀或其他作用方式；延缓害虫产生耐药性的效果，值得应用。
另外，从药品开发上，一种叫做甲氨基阿维菌素苯甲酸盐，另一种叫做富表甲氨基阿维菌素的类似药剂已经经过试验证实比阿维菌素的杀虫活性更高，对人畜毒性更低，有很好的应用前景（ buchmann k et.al,2009) 。
从整个实验结果说，新 阿维菌素制剂 对 鱼中寄生的大中华鳋 的杀灭是有效果的，并且效果比较明显。但是在安全浓度下对 鱼中寄生的大中华鳋 的杀灭作用较显著， 鱼中寄生的大中华鳋 基本死亡。由此可知，阿维菌素新制剂对成活鱼体 大中华鳋 杀灭效果较理想，在生产实践环节可以适当投入使用， 而草鱼在本实验中因为试验品原因没有进行毒性实验，而以黄颡鱼为参照标
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致谢
本设 计在 老师的悉心指导和严格要求下业已完成，从课题选择、方案论证到具体设计和调试，无不凝聚着 刘 老师的心血和汗水，在四年的本科学习和生活期间，也始终感受着导师的精心指导和无私的关怀，我受益匪浅。在此 向刘 老师表示深深的感谢和崇高的敬意。不积跬步何以至千里，本设计能够顺利的完成，也归功于各位 任课 老师的认真负责，使我能够很好的掌握和运用专业知识，并在设计中得以体现。正是有了他们的悉心帮助和支持，才使我的毕业 论文 工作顺利完成。感谢他们四年来的辛勤栽培。
再者，我要感谢和我一起度过这段实验室在实验室一起工作的同学，感谢他们的对我的帮助。同时，我还要感谢在学习期间认识的所有同学和朋友们给予的帮助。
