益气开秘方对结肠慢输型便秘大鼠肠动力和肠神经肽的影响
【摘要】 共纳入80只无特定病原体级大鼠，将60只造成结肠慢输型便秘模型，并随机分为模型组、西沙比利组和益气开秘方组（简称中药组），其余20只设为正常对照组。以碳末推进百分率、离体肠肌条收缩频率及振幅、一氧化氮合酶1（nitric oxide synthase-1， nos1）和p物质为观察指标。结果:模型组的碳末推进百分率较正常对照组明显降低（ p <0.05），中药组和西沙比利组均明显高于模型组 （ p <0.05） 。模型组与正常对照组相比，其各肠段肠肌条收缩的频率和振幅明显降低，中药组和西沙比利组与模型组比较均有提高（ p <0.05）。模型组结肠肠壁组织nos1阳性细胞面积百分比明显高于正常对照组、西沙必利组和中药组，中药组与正常对照组相比，差异无统计学意义（ p >0.05）。模型组p物质阳性细胞面积百分比较正常对照组明显下降，中药组与正常对照组相比，差异无统计学意义（ p >0.05）。结论:益气开秘方可通过提高大鼠肠道平滑肌收缩的频率和振幅来促进肠道动力。其作用途径与调控肠神经丛nos1和p物质阳性表达有关。
【关键词】 结肠疾病， 功能性
结肠慢输型便秘（slow transit constipation， stc）是由于胃肠道传输功能障碍所致的便秘，其相关发病因素众多，但确切发病机制尚未明确。近年我科以恢复胃肠传导功能为治疗原则，将益气开秘方应用于结肠慢输型便秘的临床治疗，取得了满意效果。本课题旨在通过动物实验证实益气开秘法对肠道运动的调节作用，并主要从肠道神经肽p物质（substance p， sp）和一氧化氮合酶1（nitric oxide synthase-1， nos1）的角度探讨其作用机制。
1 材料和方法
1.1 材 料
1.1.1 动物来源与品系 实验用无特定病原体级（specific pathogen free， spf）sd大鼠80只（中国科学院上海实验动物中心提供），雌雄各半，体质量180～220 g。
1.1.2 药物 益气开秘方由生黄芪30 g、生白术15 g、枳壳12 g、杏仁12 g、生地黄15 g、火麻仁15 g组成，由龙华医院制剂室按2000年版药典要求，制备成水煎剂，约含生药量2 g/ml。 根据《中药药理研究方法学》［1］计算出中药人鼠等效剂量，2 ml/次， 2次/d 灌胃。西安杨森制药厂生产的西沙必利（普瑞博思）为对照药物，规格为5 mg/片。用生理盐水溶解至约含药量0.05 mg/ml，根据《中药药理研究方法学》［1］计算人鼠等效剂量，2 ml/次，2次/d灌胃。
1.1.3 实验试剂与仪器 台氏液（每1 000 ml中含nacl 8.0 g、kcl 0.2 g、cacl20.2 g、nahco31.0 g 、nah2po40.05 g、mgcl20.1 g、葡萄糖1.0 g）、武汉博士德生物工程有限公司生产的工作浓度均为1∶80的nos1兔抗多克隆抗体和p物质兔抗多克隆抗体、sabc型免疫组化染色试剂盒、dab显色试剂盒和cw-3型平滑肌槽以及olympus公司生产的ahbt-5b通用研究显微镜。
1.2 造模方法 参考文献［2］用口服复方苯乙哌啶加酚酞的方法建立大鼠结肠慢输型便秘模型。饲喂3个月造模成功后分组给药。
1.3 动物分组及取材
1.3.1 动物分组 采用完全随机方法分为模型组、西沙必利对照组和中药组，另设正常对照组。每组各20只大鼠。分组当日起给药，连续给药4周后取 材。
1.3.2 取材 实验前24 h将大鼠禁食不禁水。每组各取10只，实验前1 h用100 g/l活性碳混悬液1 ml灌胃，灌胃1 h后脱颈处死，立即剖腹，取出从幽门到直肠末端的全部肠道，在松弛状态下测量肠道的全长及活性碳在肠道内推进的长度，计算推进百分率。每组另10只大鼠，动脉放血处死，腹正中切口进腹，快速于回盲部、升结肠及降结肠中部各取一段肠管，约2 cm长，置于台式液（ph 6.6～6.8）平皿中冲洗干净，纵行剖开肠管，剥去黏膜层，去除附着的系膜或脂肪，放在充氧、保温（37 ℃左右）的台氏液中备用。在横结肠部位取新鲜肠壁组织，放于10%中性甲醛固定液中，用于形态学观察及免疫组化实验。
1.4 观察指标与方法
1.4.1 活性碳推进试验检测肠道传输功能 碳末推进百分率（%）=（碳末前端与幽门的距离/肠道全长）×100
1.4.2 离体肠肌条动力测定 将放在充氧、保温（37 ℃左右）的台氏液中的肌条，一端固定在cw-3型平滑肌槽下端的弯钩，另一端固定于拉力换能器（量程10 g）。肌条放入含有持续充氧的台氏液容器中，待自发活动稳定后，描记正常曲线3 min，张力变化通过多道生理记录仪记录到微机，以chart 4.0软件分析记录，统计肌条收缩的振幅及频率。
1.4.3 免疫组化法检测nos1和p物质的表达 免疫组化sabc法检测nos1和p物质表达，具体方法按试剂盒说明书操作。显微镜下观察，有棕黄染色者为nos1和p物质阳性。采用德国leica（莱卡）全自动图像分析系统，对各组免疫组化切片进行图像分析。根据各组切片中的染色条件，在统一阈值下进行。在200倍显微镜下，每张切片随机选取3个视野，测定各组在统一光度下阳性细胞的阳性面积百分比。
1.5 统计学方法 采用ssps 11.5软件，碳末推进百分率、肠管肌条收缩的振幅及频率、nos1和p物质阳性细胞的积分光密度均采用方差分析的方法作组间差异的比较。
2 结果
2.1 肠道碳末推进试验检测碳末推进百分率 模型组较正常对照组明显降低，中药组和西沙比利组较模型组均明显提高，中药组与正常对照组比较，差异无统计学意义。见表1。
表1 各组碳末推进百分率的比较（略）
table 1 comparison of percentage of carbon propelling in 4 groups
*p <0.05 vs untreated group;△p <0.05 vs normal control group.
2.2 离体肠管肌条收缩活动 模型组各肠段肠管肌条收缩的频率和振幅较正常对照组明显降低。中药组和西沙比利组与模型组比较，频率和收缩振幅均有提高，差异有统计学意义。中药组和西沙比利组的升结肠段肠管肌条收缩的频率和振幅与正常对照组比较差异无统计学意义。见表2和图1。
表2 各组肠收缩频率和振幅的比较（略）
table 2 comparison of contraction frequency and amplitude of the muscle segments in 4 groups
* p <0.05 vs untreated group;△p <0.05 vs normal control group.
图1 升结肠平滑肌条收缩频率及振幅（略）
figure 1 contraction frequency and amplitude of smooth muscle segment of ascending colon of the rats in 4 groups
a: normal control group; b: untreated group; c: yqkmr treated-group; d: cisapride treated-group.
2.3 结肠肠壁组织nos1和p物质表达 正常大鼠结肠肠壁组织内p物质阳性神经元密集分布，胞体较大，而模型组p物质阳性神经元分布分散稀疏，胞体较小。正常对照组nos1阳性神经元分布稀疏，而模型组nos1阳性神经元分布明显增多。图像分析显示nos1阳性细胞面积百分比， 模型组较正常对照组、西沙必利组和中药组明显升高，中药组nos1阳性细胞面积百分比与正常对照组相比，差异无统计学意义。p物质阳性细胞面积百分比，模型组较正常对照组明显下降，其中中药组p物质阳性细胞面积百分比与正常对照组相比，差异无统计学意义。见表3、图2和图3。
表3 大鼠肠壁组织nos1和p物质阳性面积（略）
table 3 expressions of nos1 and sp in colon wall tissue of the rats in 4 groups
*p <0.05 vs untreated group;△p <0.05 vs normal control group.
图2 大鼠结肠组织nos1阳性表达（sabc，10×10）（略）
figure 2 expression of nos1 protein in colon wall tissue of the rats （sabc，10×10）
a: normal control group; b: untreated group; c: yqkmr treated-group; d: cisapride treated-group.
图3 大鼠结肠组织p物质阳性表达（sabc，10×20）（略）
figure 3 expression of sp in colon wall tissue of the rats （sabc，10×20）
a: normal control group; b: untreated group; c: yqkmr treated-group; d: cisapride treated-group.
3 讨论
结肠慢输型便秘属中医学“阴阳结”、“脾约”等范畴。我们根据中医学“阴阳结”、“脾约”的理论认识并结合本单位便秘专科10余年的临床实践，提出气化不利、气机郁滞和气虚津亏是本病的病机。针对其病机，我们认为益气开秘是恢复胃肠传导功能的关键。补益中气是直接动力，调畅气机是间接动力。若气得补养，以复其刚大之性，则冲突排荡，开秘行滞。此外，通过补气、升清降浊和蒸化津液可达补阴目的。益气开秘方中以生黄芪和生白术为君药，枳壳、杏仁理气开秘以开上窍，通下窍，促进大肠传导功能，少佐以生地以助濡养肠道。 碳末推进实验显示模型组碳末推进百分率较正常对照组明显降低，中药组和西沙比利组与模型组比较，碳末推进百分率均明显提高，说明中药有一定促进肠道动力作用。离体肌条收缩试验显示模型组肌条收缩频率和振幅较正常对照组明显下降，中药组肌条收缩频率和振幅与模型组比较均有明显提高，其中对于升结肠段振幅的恢复最为明显，与正常对照组比较，差异无统计学意义。肠道动力是由多种神经肽、神经递质及其受体构成的复杂神经内分泌网络系统调控。其中一氧化氮（nitric oxide， no）是主要的抑制性神经递质，神经丛内的nos1神经元通过释放no而抑制结肠推 进性收缩。研究表明stc患者结肠壁肌间丛和黏膜下丛nos1表达均增高，从而释放大量的no，导致结肠推进性收缩受抑制［3］。sp神经元属于肽能神经元，sp是刺激肠道运动的主要兴奋性神经递质。stc患者结肠壁肌间神经丛sp能神经元减少或功能降低［4～6］。童卫东等［7］应用nos1和sp的兔多克隆抗体，对手术切除的15例stc患者和 11例 对照组乙状结肠慢输型便秘患者标本进行免疫组化染色和半定量分析，结果stc患者乙状结肠肌间神经丛nos1免疫反应性明显升高，而sp免疫反应性明显降低。黏膜下神经丛nos1及sp免疫反应性与对照组的差异无统计学意义，认为stc结肠神经系统nos1和sp免疫反应性的异常变化可能是其结肠传输减慢的神经病理基础。本实验免疫组化结果显示正常大鼠结肠肠壁组织内sp阳性神经元密集分布，胞体较大，而模型组sp阳性神经元分布稀疏，胞体较小。正常对照组nos1阳性神经元分布稀疏，而模型组nos1阳性神经元分布较正常对照组明显增多。研究结果表明本次实验所采用的大鼠stc病理模型可以反映出nos1和sp在stc发生过程中的病理变化。研究进一步显示中药组和西沙必利组nos1阳性细胞面积百分比较模型组明显降低，其中中药组nos1阳性表达与正常对照组相比，差异无统计学意义;而中药组和西沙必利组sp阳性细胞面积百分比较模型组均明显升高，其中中药组sp阳性表达与正常对照组相比，差异无统计学意义。以上结果均表明益气开秘方促进肠道动力的作用可能与上调sp的阳性表达和抑制nos1的阳性表达有关，并通过调控肠道动力网络中的兴奋和抑制性神经递质之间的平衡来达到恢复肠道自然生理功能的目的。
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