低剂量辐射对荷s180肉瘤小鼠肿瘤组织mmp2和timp2表达影响
【关键词】 放射治疗剂量；肉瘤180；明胶酶a；金属蛋白酶2组织抑制剂
【摘要】 目的 探讨低剂量辐射对荷s180肉瘤小鼠肿瘤组织中基质金属蛋白酶2（mmp2）、金属蛋白酶组织抑制因子2（timp2）表达的影响。方法 昆明种小鼠皮下接种s180肉瘤细胞，待肿瘤形成后将小鼠随机分为假照组（n组，40只）和低剂量辐射组（ldr组，40只），n组予以无射线假照射，ldr组给予一次性75 mgy的60co射线全身照射。n组于假照射后12 h处死，ldr组分别于照射后12、24、48、72 h处死。分别取肿瘤称质量，免疫组化染色检测肿瘤组织中mmp2、timp2表达情况。结果 与n组相比，75 mgy射线全身照射后小鼠肿瘤生长缓慢（t=2.19，p＜0.05）。ldr组小鼠低剂量照射后不同时间timp2表达与n组比较，差异无统计学意义（p＞0.05）；mmp2的表达在照射后24、48 h较n组明显下降，差异均有显著性（u=2.15、2.04,p<0.05）。结论 低剂量全身照射可以明显抑制肿瘤生长，降低mmp2的表达，从而抑制肿瘤的浸润和转移。
【关键词】 放射治疗剂量；肉瘤180；明胶酶a；金属蛋白酶2组织抑制剂
effect of low dose radiation on tumor expressions of mmp2 and timp2 in s180 sarcomabearing mice
zhang yanmin, yu hongsheng
(department of oncology, the affiliated hospital of qingdao university medical college, qingdao 266003, china);
［abstract］ objective to investigate the effect of low dose radiation (ldr)on expressions of mmp2 and timp2 in s180 sarcomabearing mice. methods a tumor model of s180 sarcomabearing mice was created by subcutaneous inoculation of s180 sarcoma cells into kunming strain mice. the mice were then divided into shamradiation group (n group, 40 mice) and low dose radiation group (ldr group, 40 mice). the mice in ldr group were given single dose of 75 mgy for wholebody γray radiation; those in n group were radiated with no ray, and sacrificed 12 h after shamradiation; those in ldr group were sacrificed 12 h(ldr12 h group), 24 h (ldr24 h group), 48 h (ldr48 h group) and 72 h (ldr72 h group) after radiation. tumor weight was determined, and the expressions of mmp2 and timp2 detected by immunohistochemical method. results compared with n group, wholebody exposure to 75 mgy γray in ldr group significantly slowed down the tumor growth of mice (t=2.19,p<0.05). after low dose radiation, the expression of timp2 at different time points in ldr group were not significantly different from those observed in n group (p>0.05). the mmp2 expression was significantly reduced in ldr24 h group (u=2.15,p<0.05) and ldr48 h group (u=2.04,p<0.05) compared with that of n group. conclusion low dose wholebody radiation could significantly suppress the growth of tumor and reduce the expression of mmp2, therefore inhibit the infiltration and metastasis of tumors.
［key words］ radiotherapy dosage; sarcoma 180; gelatinase a; tissue inhibitor of metalloproteinase2
大量研究资料显示，低剂量全身照射从整体、细胞及分子水平均未表现出明显的损伤效应。低剂量照射可对机体产生兴奋性效应和适应性反应等有益作用，可促进生长、繁殖，增强免疫，刺激修复以及增强辐射抗性等。从分子、细胞及整体水平对低剂量辐射生物学效应的研究，为低剂量全身照射应用于临床实践奠定了基础。本实验旨在通过研究低剂量辐射与基质金属蛋白酶2（mmp2）及金属蛋白酶组织抑制因子2（timp2）表达的关系，进一步讨论低剂量辐射的抑瘤机制，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
spf级昆明种小鼠80只，雄性，体质量（18±22）g，4～6周龄，购自青岛市药品检验所，常规饲养，不限食物。小鼠s180肉瘤细胞（购自山东省医学科学院基础医学研究所），腹水传代，第2代用于实验。mmp2兔抗人单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，timp2兔抗人单克隆抗体购自圣克鲁斯生物技术公司；pv免疫组化试剂盒、pbs、dab显色液，均购于北京中杉金桥生物技术公司。
1.2 动物模型的建立
s180肉瘤细胞腹腔传代2次，无菌抽取腹腔积液2 ml，加入3倍无菌生理盐水稀释，锥虫蓝计数，细胞活力>95%时，将处于对数生长期的细胞按常规方法制成6.5×1010／l细胞悬液。实验小鼠右后肢皮肤消毒，皮下接种6.5×106个(0.1 ml)细胞，整个过程于1 h内完成。
1.3 实验动物分组及处理
小鼠常规饲养，观察肿瘤生长。接种肿瘤后第7天，选择肿瘤平均体积差异无显著性的荷瘤小鼠，随机分为假照组（n组）和低剂量辐射组（ldr组）。所有ldr组小鼠均接受60co射线全身照射，采用fcc8000型同中心回转式60co治疗机（山东新华医疗器械股份公司），使用自制纸盒盛装小鼠，机头与纸盒中间放置15 cm×15 cm的铅板滤过射线，照射距离为160 cm,照射野面积45 cm×45 cm,射线剂量率为15.9 mgy/min,照射时间为4.72 min,总剂量75 mgy,均为一次性全身照射。n组接受无射线假照射。分别于照射后12、24、48、72 h脱颈处死小鼠。
1.4 检测指标与方法
1.4.1 肿瘤生长情况
处死小鼠后暴露瘤组织，用游标卡尺测量肿瘤水平方向最大长径a(cm)及垂直方向最大横径b(cm)，各重复两次，取平均值，按下列公式计算肿瘤平均体积（v）：v=1/2 ab2。
1.4.2 mmp2和timp2表达的检测
采用免疫组化powervisiontm二步法。按试剂盒说明书方法进行操作，显微镜下观察。以pbs代替一抗作为阴性对照。
1.4.3 结果判断
mmp2和timp2阳性染色主要为细胞膜和（或）细胞质内出现棕黄色颗粒，主要表达于肿瘤细胞和（或）瘤旁的间质。mmp2在肿瘤间质中的纤维细胞亦大量表达。二者阳性表达不均匀，常呈灶状或片状分布，在靠近肿瘤边缘和浸润活跃处细胞表达较多，染色较深。mmp2、timp2蛋白表达强度根据阳性物质着色深浅及阳性细胞的百分比分为4级：显微镜下计数200个细胞，（-）为阳性细胞数＜5%；（+）为阳性细胞数5%～25%，染色较浅；（）为阳性细胞数26%～50%，呈棕黄色；（）为阳性细胞数＞50%，染色较深。
1.5 统计学处理
应用ppms 1.5[1]统计学软件进行数据处理，计量资料结果以±s表示,两组均数比较采用t检验，半定量资料比较采用秩和检验，以p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 小鼠一般状态及各组肿瘤体积比较
照射后12 h，ldr组小鼠比n组小鼠的精神状态好，更活跃。照射后72 h ldr组的肿瘤体积小于n组，差异有显著意义(t=2.19,p<0.05)。见表1。表1 低剂量辐射对肿瘤生长的影响（略）
2.2 两组 mmp2、timp2表达比较
ldr组低剂量照射后不同时间小鼠timp2表达与n组比较，差异无统计学意义（p>0.05）；mmp2的表达在照射后24、48 h较n组明显下降，差异均有显著意义（u=2.15、2.04,p<0.05）。见表2、3。表2 两组不同照射时间mmp2表达强度的比较，表3 低剂量辐射对肿瘤细胞timp2表达的影响（略）
3 讨论
联合国原子辐射效应科学委员会(nscear）1986年报告规定，就人体而言，低水平辐射指剂量在0.2 gy以内的低let辐射或0.05 gy以内的高let辐射，同时剂量率在0.05 mgy/min以内。在实际研究中，把照射剂量符合上述条件而剂量率高于0.05 mgy/min者称低剂量辐射。低剂量辐射抗肿瘤效应的深入研究在恶性肿瘤的治疗中有很大的发展前景[2]。国内外学者从不同角度对低剂量电离辐射的抗瘤作用进行了大量研究,证明低剂量全身或仅是脾区辐射可刺激动物的生长、发育,可延长动物寿命,提高生育力,同时还发现其可增强动物和人体的免疫功能,促进肿瘤细胞发生凋亡[3]，降低肿瘤发生率并能与肿瘤治疗起到协同作用，并探讨了低剂量全身照射增加免疫反应机制[4]。有关低剂量辐射与肿瘤转移的研究较少。黄帼等[5]研究小鼠眼静脉注射b16黑色素瘤细胞24 h后，进行75 mgy的x线全身一次照射，结果显示，照射后小鼠的肺转移结节数明显低于对照组。张英等[6]研究显示，化疗前预先用75 mgy的x射线全身照射对mmc免疫抑制的减轻作用，可能是其增强化疗抑制lewis肺癌转移的重要基础。齐鲁医学杂志2010年6月第25卷第3期 med j qilu, june 2010, vol.25, no.3
肿瘤的浸润和转移是肿瘤细胞与肿瘤基质成分共同参与的过程。liotta提出肿瘤浸润三步学说，即黏附、降解和移动，首次明确提出肿瘤浸润与肿瘤细胞间质降解之间的关系。肿瘤转移的过程虽然很复杂，但其中的最基本步骤是癌细胞对细胞外基质（ecm）和血管基膜的降解和破坏。基膜是阻止肿瘤细胞浸润扩散过程中的一道天然屏障。正常基膜由ⅳ型胶原等成分构成，为一致密的网状结构，固有细胞不能正常通过。mmps是一类锌离子依赖的细胞外蛋白水解酶，可降解基膜，由于mmps能有效降解ecm，因此，mmps在肿瘤浸润与转移行为中起着重要作用[7]。近年来的研究结果表明，肿瘤细胞分泌的mmps中，mmp2（明胶酶a,相对分子质量72 000）和mmp9(明胶酶b,相对分子质量为92 000)是降解ⅳ型胶原最主要的酶，其在肿瘤的血管化、肿瘤细胞浸润和转移灶的形成过程中均起重要作用。而组织金属蛋白酶抑制物（timps）与相应的mmps酶原及其活化形式结合，从而抑制mmps的产生及其活性，是肿瘤发生恶变与转移的阻抑因素。已有研究结果表明，mmptimp调节失衡在肿瘤恶变与转移过程中起重要作用[810]。但低剂量辐射与两者的关系尚未见报道。
本实验研究低剂量辐射对荷s180肉瘤小鼠肿瘤组织中mmp2、timp2表达的影响，结果显示，与假照组相比，75 mgy射线全身照射后小鼠肿瘤生长缓慢。同时，ldr组低剂量照射后不同时间小鼠timp2表达与n组比较，差异无统计学意义；mmp2的表达在照射后24、48 h较n组明显下降，差异显著性。表明低剂量全身照射一定时间内可降低mmp2的表达，从而减少基膜的降解，抑制肿瘤的浸润和转移，对低剂量辐射抗肿瘤机制的研究有一定的指导意义。
综上所述，适当的低剂量辐射可抑制肿瘤生长，mmp2表达的降低可能是低剂量辐射抑制肿瘤转移的机制之一。鉴于本实验研究样本数较少，其结果有待进一步扩大样本量予以证实。低剂量全身照射具有抑瘤作用已得到证实，但低剂量辐射的抑瘤机制尚不甚明确且临床应用较少。有关低剂量全身照射与肿瘤转移与浸润关系方面的研究较少，有待进一步研究。
【参考文献】
[1] 周晓彬,纪新强,徐莉. ppms 1.5统计软件的功能及其应用[j]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(1):9193.
[2] 封丽,邓大平. 低剂量辐射抗肿瘤治疗的研究进展[j]. 中国辐射卫生, 2006,15(3)：377378.
[3] liu q, yu h s. effects of low dose radiation combined with cyclophosphamde on tumor cell apoptosis,cell cycle and proliferation of bone marrow in tumorbearing mice[j]. 齐鲁医学杂志, 2008,23(1):35.
[4] safwat a. the immunobiology of low dose total body irradiation: more questions than answers[j]. radiat res, 2000,153(5 pt 1):599604.
[5] 黄帼,汪恩应. 低剂量电离辐射对小鼠肿瘤转移及免疫功能的影响[j]. 肿瘤防治研究, 1996,23(3)：161163.
[6] 张英,李修义. 低剂量辐射增强化疗药物抑制lewis肺癌转移的实验研究[j]. 白求恩医科大学学报, 1997,23(6)：579581.
[7] herrea c a, xu l, bucana c d, et al. expression of metastasisrelated genes in human epithelial ovarian tumors[j]. int j oncol, 2002,20(1):513.
[8] 商冠宁,王玉名. mmp2、timp2在骨肉瘤侵袭转移中的作用[j]. 实用肿瘤学杂志, 2007,21(3):218220.
[9] 陈龙邦,李桂圆. mmp2和timp2在非小细胞肺癌中的表达及临床意义[j]. 肿瘤防治杂志, 2003,10(6):598601.
[10] 李芳,张淑兰. mmp2、mmp9及timp2、timp1在宫颈鳞癌中的表达及其意义[j]. 临床肿瘤学杂志, 2006,11(6):450454.
