【摘要】 目的探讨胃癌组织胸苷酸合成酶增强子区(tser)多态性与5fu体外药敏的关系。方法对45例胃癌患者新鲜标本进行体外肿瘤细胞原代培养，用atptca法检测肿瘤细胞对5fu的敏感性并用pcr法检测肿瘤的tser多态性，分析tser多态性分布频率与体外药敏有效率的关系。结果tser多态性三种基因型频率分布： 2r／2r、2r／3r、3r／3r基因组分别为6.7%(3/45)、31.1%(14/45)和62.2%(28/45)。5fu总有效率为33.3%(14/42)。3r／3r基因组26例,有效5例,无效21例,有效率19.2%；（2r／2r、2r／3r）基因组16例，有效 9例，无效7例,有效率56.3%。tser基因型组之间对5fu敏感性存在显著差异性（p<0.05）。结论tser多态性对5fu化疗敏感性可能有关,基因型检测可能有助于预测胃癌组织对5fu化疗敏感性。
【关键词】 胃癌;胸苷酸合成酶增强子区多态性; 5氟尿嘧啶;体外药敏试验
correlation between tser polymorphism and sensitivity of gastric cancer tissue to 5fluorouracil
he wenxing1,deng jinyun1,sun zhengkui1,wang yanhua1,chen wenxue1,liu hongsheng2
1.jiangxi provincial cancer hospital，nanchang 330029，china；2.medical department ,graduate school of nanchang university
corresponding author:deng jinyun,email: [email protected]：objective to investigate correlation between thymidylate synthase enhancer region (tser) polymorphism and the antitumor activities of 5fluorouracil (5fu) determined by atp sensitivity assay in vitro.methodsthe carcinoma cells isolated from fresh gastric tissue in 45 patients were cultured in vitro.the sensitivity of these cells to 5fu were tested using atptca method. tser genotypes were detected by pcr and the correlation between different of tser genotypes and its chemosensitivity to 5fu was analyzed in this study.resultsin all cases, the frequency distribution of tser 2r／2r、2r／3r and 3r／3r genotypes were 6.7%(3/45)、31.1%(14/45) and 62.2%(28/45), respectively. the overall effective rate of 3r/3r group to 5fu was 33.3%(14/42). in 2r／2r and 2r／3r genotype group its effective rate to 5fu was 56.3%(9/16), which was significantly higher than that of 3r／3r genotype group（19.2%，p<0.05).conclusionsthe results in the present study suggest that the polymorphism of tser was associated with the antitumor activities of 5fluorouracil, indicating that analysis of tser polymorphisms might be useful to direct 5fluorourcilbased antitumor chemotherapy.
key words：gastric cancer；thymidylate synthase enhancer region (tser) polymorphism; 5fluorouracil; chemosensitivity assay in vitro
1资料和方法
1．1临床资料收集2005年9月~2007年11月期间外科手术的胃癌患者新鲜标本45例，所有患者均在术后病理证实为胃癌。所有患者术前均未接受过化、放疗。其中男29例,女16例。患者年龄35~71岁，平均年龄51岁。浸润深度，pt1为4例、 pt2为13例、pt3和pt4分别为23例和5例。有淋巴结转移33例，无淋巴结转移12例。
1．2标本处理 新鲜标本分为两份,一份装入含有100u/ml的青霉素、100μg/ml链霉素的rpmi1640的离心管中，立即送于atptca法体外药物敏感性检测;另一份放入液氮中，转置-80℃冻存以备pcr法检测其ts基因多态性。
1．3atptca法体外药敏试验和pcr法检测其ts基因型
1．3．1atptca法体外药敏试验atptca核心试剂盒（德国dcs），购自深圳达科为生物技术公司；胶原酶ⅳ、透明质酸酶ⅴ、dna酶ⅰ、ficollhypaque均购自上海试剂二厂；rpmi1640干粉购自gibco公司。按照试剂盒使用说明书操作进行。配制8000％血浆峰浓度（peak plasma concentration,ppc）的化疗药物，100％ppc 5fu：22.5μg/ml(试剂盒说明书附录)；配制细胞解离酶。制备癌细胞悬液：无菌条件下清洗癌组织，清除脂肪,纤维组织,血块及坏死组织，将癌组织充分剪成小碎块，然后加入解离酶液，37℃孵育6h，将细胞解离液通过300目的钢网过虑，1500r/min，离心5min×2，用rpmi1640重悬制备成单细胞悬液。ficollhypaque梯度分离。肿瘤细胞原代培养癌细胞悬液用完全分析培养基稀释，调整细胞浓度至2.5×105个/ml；以每孔0.1ml接种至96孔培养板内。按400%、200%、100%、50%、25%和12.5%的血浆峰值浓度，将药物加入培养孔每孔0.1ml，每个浓度3个平行孔，并设最大抑制（mi）和无药物（mo）对照孔，置于37℃、5%co2、＞95%湿度下细胞培养箱中孵育6d。atp提取和发光度测定。dcs电子数据表自动算出tgi、auic、ic50、ic90和s．i。高auic，低ic50、ic90、s．i.值和高tgi值，显示100%肿瘤细胞生长抑制，药物的敏感性高。低auic，高ic50、ic90、s．i.值和低tgi值，表示药物的高耐药性。atptca结果评估[2]：强敏感（ss）：ic90<100% ppc和ic50≤25% ppc；中度敏感(is)：ic90＞100% ppc和ic50≤25% ppc。弱敏感(ms)：ic90<100% ppc和ic50＞25% ppc。耐药(r)：ic90>100% ppc和ic50＞25% ppc。体外有效=ss+is；体外无效=ms+r。
1．3．2pcr法检测其ts基因型提取dna过程：胃癌标本dna的提取,按照试剂盒说明操作进行。dna提取试剂盒购自tiangen公司，型号为tianamp genomic dna kit；引物由上海generay公司合成；2×taq pcr mastermix购自tiangen公司；琼脂糖由西班牙biowest公司生产。上游引物5′gtggctcctgcgtttccccc3′,下游引物5′gctccgagccggccacaggcatggcgcgg3′[3],反应体系为25μl，其中0.2μg dna模板，引物各1μl,2×mastermix12.5μl，加双蒸水至25μl。反应条件:预变性94℃ 3min，后续循环94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 60s、30个循环后，72℃延长5min。反应结束后取5μl反应产物，用2%琼脂糖凝胶电泳。胸苷酸合成酶增强子区(tser)多态性判断标准[4]:pcr扩增产物215bp(双串联重复系列纯合子)为2r/2r，243bp（三串联重复系列纯合子）为3r/3r，215bp/243bp（两者的杂合子）为2r/3r。基因测序:pcr产物纯化及dna测序参照试剂盒说明书,核苷酸顺序经xm2007410c1全自动dna测序仪读序。
1．4统计学方法统计分析用ssps13.0软件进行。用χ2检验或fisher精确检验法分析,p<0.05为差异有统计学意义。
2结果
基因型检测结果： 2r/2r、2r／3r、3r／3r基因型分别为3例、14例和28例。体外药敏检测结果：45例胃癌组织5fu体外药敏检测，3例有失败，其中1例细胞数少，2例为培养板污染。体外有效14例(33.3%)；体外无效28例(66.7%)。
42例标本中,3r／3r基因型26例,有效 5例，无效21例;2r／3r基因型13例，其中有效 7例，无效6例；2r／2r基因型占3例,其中有效2例,无效1例。3r／3r基因型组与（2r／2r、2r／3r）基因型组之间对5fu敏感性差异有统计学意义（p<0.05）。
42例标本中,男性患者标本为27例,体外有效率29.6%;女性患者标本为15例,体外有效率40.0%，高于男性有效率,但差异无统计学意义。患者年龄范围35~71岁,中位年龄53岁,以中位年龄为切点分组,53岁以下患者肿瘤标本组20例;53岁及以上患者肿瘤标本组22例 （p>0.05）。浸润深度: pt1+pt2组体外有效率37.5%,高于pt3+pt4组有效率30.8%（p>0.05）。有淋巴结转移组31例，体外有效率32.3%；无淋巴结转移组11例,体外有效率36.4%（p>0.05），见表1。本研究中发现性别、年龄、浸润深度、淋巴结转移与5fu体外药敏无关。表1患者基本情况和tser多态性与5fu药敏的关系
3讨论
3.1tser多态频率分布 可能由于遗传背景的多样性和复杂性,不同种族人群中ts基因多态分布频率有很大差别。余开焕等[5]通过pcr技术检测160例原发性胃癌、结直肠癌患者tser多态性。结果: 2r/2r、2r/3r及3r/3r,分别为8%、24%、68%。本研究tser多态性三种基因型分布： 2r／2r、2r／3r、3r／3r基因组分别为6.7%(3/45)、31.1%(14/45)和62.2%(28/45)。与余开焕等［5］检测tser多态频率分布的结果相差不大。
3.2体外药敏 atp体外药物敏感性检测是体外观察化疗药物与细胞作用最直接的方法,是通过细胞内atp与荧光素荧光素酶复合物作用产生可测定荧光,检测荧光值计算atp量来反映活细胞数,具有相对敏感、快速、与临床相关性较好的特点。田海梅等[6]通过atptca研究大肠癌5fu单药敏感性为29.1％,认为与临床报道的大肠癌单药有效率21%基本相符。本研究胃癌5fu单药敏感性为33.3%，与临床报道的胃癌单药有效率21%相差不大[7]。
3.3胃癌组织tser多态性与5fu敏感性 基因多态性可引起不同个体药理学及毒理学效果差异。抑制ts 是5fu发挥其抗癌活性的途径，故ts蛋白高表达时，5fu的敏感性差。三种基因型导致肿瘤细胞中ts表达水平不同。在ts基因型与蛋白表达关系的研究中，3r/3r基因型蛋白表达效率通常较2r/2r、 2r/3r基因型高。morganti等[8]通过48例结直肠癌患者研究显示3r/3r基因型的癌组织tsmrna表达水平显著高于2r/2r、 2r/3r基因型。本研究中3r／3r基因型组相对（2r／2r、2r／3r）基因型组对5fu敏感性差。villafranca e等[9]研究直肠癌患者结果示:3r/3r基因型组与（2r/3r、2r/2r）基因型组经以5fu为基础的化疗的降期率分别为22%和60%，表明（2r/3r、2r/2r）基因型组化疗降期率较3r/3r基因型组要高。（2r/3r、2r/2r）基因型与3r/3r基因型3年无病生存率分别为81%和41%。认为ts重复序列多态性可作为肿瘤降期的预测指标，可作为5fu为基础化放疗方案疗效预测新手段。因此，药物基因组学是一个有效预测药物和毒性的重要工具；ts基因多态性能准确、快速、有效地预测氟尿嘧啶类药物的耐药性和毒性[10]。本研究中3r／3r基因型组相对（2r／2r、2r／3r）基因型组对5fu敏感性差,差异有统计学意义（p<0.05）,认为tser多态性对5fu化疗敏感性可能有关,基因型检测可能有助于预测胃癌组织对5fu化疗敏感性。 本研究仅检测了ts基因,而没有考虑胸苷磷酸化酶(tp) 基因、胸苷激酶(tk) 基因等因素对5fu敏感性的影响,体外药敏不能完全反应人体内环境药敏,因而具有一定的局限性。目前国内外对ts基因多态性与5fu敏感性的关系报道也不多,故尚需进行大样本前瞻性随机对照研究,以进一步验证该研究结果,更好地指导治疗。
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