【摘要】 目的 探讨趋化因子受体cxcr4在人鼻咽癌中的表达及临床意义。方法 采用 realtime rtpcr法检测鼻咽癌细胞株中cxcr4 mrna的表达，应用免疫组织化学法并结合组织阵列检测正常鼻咽组织、鼻咽癌和鼻咽癌淋巴结转移石蜡组织标本中cxcr4蛋白的表达情况。结果 在7种鼻咽癌细胞株中，cxcr4基因在高成瘤、高转移潜能的5－8f细胞中表达水平最高，在无转移能力的610b细胞中表达最低。cxcr4蛋白在正常鼻咽组织、鼻咽癌和鼻咽癌淋巴结转移组织中表达差异具有统计学意义（p=0.002）；鼻咽癌组织中cxcr4表达高于正常鼻咽组（p=0.029）；伴发转移的鼻咽癌组织比未发生转移的鼻咽癌组织cxcr4表达增强，差异具有统计学意义（p=0.008）；淋巴结转移癌组织cxcr4表达比鼻咽癌组织高（p=0.013）。结论 本研究提示cxcr4表达与鼻咽癌转移存在密切关系，cxcr4表达可作为鼻咽癌转移过程中一个有价值的指标。
【关键词】 鼻咽癌 转移 趋化因子受体4
鼻咽部淋巴组织丰富，致使很多患者在无鼻咽症状时即发生颈部淋巴结转移。此外，鼻咽癌骨、肺和肝等器官的转移，也比其他头颈部肿瘤常见[1]。虽然原发鼻咽癌对放射治疗比较敏感，但多数患者死于淋巴结和其他远隔器官的转移，鼻咽癌患者5年生存率仅为50%左右[2]。最近研究发现，一些趋化因子及其受体与肿瘤的侵袭和转移密切相关。本研究中，采用realtime rtpcr检测趋化因子受体4（chemokine receptor cxcr4）在鼻咽癌细胞株中的表达，并应用免疫组化方法检测cxcr4在正常鼻咽组织、鼻咽癌及淋巴结转移癌中的表达，初步探讨cxcr4的表达与鼻咽癌转移的关系。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 鼻咽癌细胞株58f、610b、c6661、cne1、cne2、hone1和hne1等均为本研究所保存。58f和610b为鼻咽癌细胞株sune1亚株，由中山医科大学肿瘤研究所建立。58f细胞具有高成瘤、高转移潜能，610b具有成瘤、不转移能力[3]。细胞培养在37℃、5%co2培养箱中，用含10%新生牛血清的rpmi1640培养基培养。
1.1.2 组织标本 收集2002～2004年广东省江门市中心医院病理科鼻咽慢性炎蜡块32例，其中男23例、女9例，32～72岁（平均52岁）；鼻咽癌组织标本蜡块77例，男52例、女25例，年龄28～75岁（平均50岁）；鼻咽癌淋巴结转移蜡块12例，男8例、女4例，年龄28～73岁（平均53岁）。全部病例检查前均未接受化学及放射治疗，标本均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋。
1.1.3 主要试剂 trizol试剂购自invitrogen公司，dnase i购自roche公司，reverse transcription system试剂盒购自promega 公司，sybr green i 荧光染料购自stratagene公司， cxcr4及内参βactin基因pcr引物采用primer 3.0在线软件设计、上海英骏生物公司合成。兔抗人cxcr4抗体购自武汉博士德生物工程有限公司、ultra sensitive sp免疫组化试剂盒购自福建迈新生物技术开发有限公司。
1.1.4 主要仪器 realtime pcr仪（stratagene, mx3000p），组织阵列仪（beecher instruments，mta1）。
1.2 方法
1.2.1 细胞rna提取及逆转录 取生长状态良好的细胞，用冰预冷的pbs冲洗2次，参照trizol试剂说明书提取各细胞总rna。总rna用dnase i 消化去除残余的基因组dna。取1μg rna按照逆转录试剂盒操作程序进行逆转录反应。
1.2.2 realtime pcr检测cxcr4基因的表达 采用sybr green i 荧光染料法，以看家基因βactin为内对照，检测cxcr4基因在各个细胞中的表达水平，重复3次。25μl反应体系中包括：2×sybr green pcr master mix 12.5μl，cdna模板1μl，上下游引物250nm。cxcr4上游引物：5′ttatcctgcctggtattgtc3′ ;下游：5′caaggaaagcatagaggatg3′。βactin上游引物：5′taaggagaagctgtgctacg3′;下游：5′gactcgtca tactcctgctt3′。
1.2.3 组织阵列的制备 利用病理科常用的国产石蜡（茂名市顺和蜡厂，熔点60℃）按常规方法制作空白蜡块作为受体蜡块，选取不同病例存档的石蜡包埋组织作为供体蜡块。首先对供体蜡块组织的he染色切片作形态学观察，选择有代表性的区域，在相应位置作标记。然后采用组织阵列仪的受体针在受体蜡块上制备受体针孔，再用供体针在供体蜡块的标记部位取直径为0.6mm的组织芯，将供体组织芯放入受体蜡块的受体孔中。依次添入组织芯，并记录填入蜡孔的每个标本在二维阵列中的具体位置，并在一定位置上标记出组织阵列的方向，见图1 。制做好的组织阵列蜡块4μm厚连续切片，4℃保存备用。
1.2.4 免疫组化方法检测cxcr4的表达及结果判断 免疫组化方法按照试剂盒说明书操作。cxcr4抗体工作浓度为1∶200，dab显色，苏木素复染，中性树胶封片。以乳腺癌组织中cxcr4蛋白的表达作为阳性对照，pbs液代替一抗作为阴性对照。以棕黄色为阳性信号，按照染色深浅，阳性分为弱阳性（+）、阳性（++）与强阳性（+++）。
1.2.5 统计方法 用spss 13.0统计软件进行处理，统计方法采用非参数kruskalwallis test，两两比较采用mannwhitney test。
2 结果
2.1 cxcr4基因在鼻咽癌细胞中的表达
7种鼻咽癌细胞株的总rna经紫外分光光度计测定a260/a280比值在1.8～2.0间，1％琼脂糖电泳检测有清晰的28s和18s带，说明rna无降解，质量较好，经逆转录成cdna，进行realtime pcr检测。7种细胞中cxcr4基因的表达水平。反应结束后自动计算出ct值（c代表cycle，t代表threshold），即每个反应管中的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。每个反应管的ct值与该模板的起始拷贝数呈对数线性关系， ct值越小表示起始拷贝数越多，基因表达量越大。可以通过看家基因的ct值计算出某个基因的相对表达量δct [δct=ct(target gene)-ct(housekeeping gene)]。采用realtime pcr检测cxcr4基因在7种鼻咽癌细胞株中的表达情况，结果表明58f细胞中cxcr4表达最高（δct＝8.27±1.61），在610b细胞中表达最低（δδct＝14.64±0.68），而在c6661（δct＝13.58±0.9）、cne1（δct＝12.04±1.52）、cne2（δct＝9.25±1.63）、hone1（δct＝11.69±1.56）、hne1（δct＝12.24±1.01）细胞中的表达水平介于两者之间。为使结果直观明确，我们采用（25-δct）来表示基因的表达水平，见图2。
图1 鼻咽上皮、鼻咽癌和鼻咽癌淋巴结转移组织阵列
图2 realtime rtpcr 检测鼻咽癌细胞株中
cxcr4 mrna的表达
2.2 cxcr4蛋白的表达
组织阵列的免疫组化结果显示，cxcr4在正常鼻咽组织、鼻咽癌和淋巴结转移癌中表达的阳性信号为棕黄色，位于细胞膜和细胞质，见图3。cxcr4在3种类型的组织中表达差异具有统计学意义（χ2＝12.740,p=0.002），见表1。两两比较发现，鼻咽癌中cxcr4的表达水平高于正常鼻咽上皮组织(z=-2.187，p=0.029)，淋巴结转移癌组织cxcr4的表达高于鼻咽癌组(z=-2.496，p=0.013)；在鼻咽癌组织中，伴发转移的鼻咽癌组织比未发生转移的鼻咽癌组织中cxcr4表达明显增强，差异具有统计学意义(z=-2.640，p=0.008)。结果表明，cxcr4蛋白的表达与鼻咽癌转移相关。表1 cxcr4蛋白在正常鼻咽上皮、鼻咽癌和鼻咽癌淋巴结转移中的表达分布
3 讨论
许多肿瘤细胞、肿瘤间质细胞和宿主细胞能自主分泌趋化因子及表达趋化因子受体。肿瘤相关趋化因子不仅可促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡，而且还可以引起细胞内肌动蛋白的聚合和伪足的形成，调节肿瘤细胞的运动和迁移，调节肿瘤血管生成，趋化淋巴细胞浸润肿瘤组织等[4]。一些恶性肿瘤倾向于特异性地转移到远处的某些组织器官，趋化因子及其受体的特异性表达很可能是其中的一个重要步骤。目前已发现至少20余种不同类型的肿瘤细胞表达趋化因子受体cxcr4,并与其配体sdf1相应答[5]。muller等[6]研究发现，与正常乳腺组织比较，人乳腺癌细胞系趋化因子受体cxcr4、ccr7高表达，免疫组化结果也证实乳腺癌原发灶及腋窝淋巴结、肺和肝癌转移灶中cxcr4、ccr7表达增高；同时在乳腺癌转移最为常见的淋巴结器官如腋窝淋巴结、肺与骨髓中cxcr4、ccr7相应配体cxcl12/sdf1和ccl21也高表达。
realtime pcr技术是近年发展起来的一项检测基因表达的非常方便、快捷、准确的实验方法。它不同于通过检测电泳产物的灰度值来判断基因表达强弱的传统定量pcr方法，是通过计算反应管中的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数，即ct值来比较反应体系中模板起始浓度的量，具有敏感、特异、快速等优点，已在基础研究和临床诊断方面被广泛用于核酸定量。组织芯片技术将不同的组织标本固定在阵列上，能同时对上千份标本中某一特定基因及其表达产物进行研究，特别是研究特定基因的蛋白表达与疾病之间的相互关系；真正地为疾病的分子诊断和预后评估标志物的筛选、治疗靶点的定位、抗体和药物筛选等提供了一种高通量的新工具。因预研究的组织标本固定在同一玻片上，实验操作过程完全一致，因此实验结果更具有可比性。
本研究采用realtime pcr、免疫组化并结合组织阵列技术，对cxcr4基因和蛋白的表达水平进行研究，结果显示，伴发转移的鼻咽癌组织比未发生转移的鼻咽癌组织中cxcr4表达明显增强，鼻咽癌颈部淋巴结转移组织中cxcr4表达明显高于鼻咽癌组织的表达，说明cxcr4蛋白的表达与鼻咽癌转移高度相关。由此我们推测cxcr4在鼻咽癌侵袭、转移过程中具有重要的作用。此外，我们用realtime pcr方法检测了鼻咽癌细胞株中cxcr4基因的表达水平，发现在具有成瘤、高转移潜能的58f细胞中，cxcr4表达水平最高，尤其是高于同一亲本来源的仅成瘤、不转移的610b细胞。这一结果提示，cxcr4很可能是鼻咽癌转移的促进基因。此外，已有研究证实cxcr4唯一的配体cxcl12在淋巴结、肺、肝和骨髓中表达[6]，这可能与鼻咽癌经常发生淋巴结、肺、肝等器官的转移有关。
cxcr4在肿瘤转移中发挥重要作用，应用抑制趋化因子、趋化因子受体及其相互作用的治疗，对防止鼻咽癌转移可能十分有效，值得进一步探讨。
【参考文献】
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