【摘要】 目的 探讨pkcα,cyclind1和cdk4在大肠癌中表达的相关性及其与临床病理学特征的关系。方法 应用免疫组化sp法对83例大肠组织中pkcα,cyclind1和cdk4的表达进行检测。结果 pkcα在大肠癌组织中阳性表达31/47（66.0%）与正常组织3/15（20.0%）及腺瘤10/21（47.6%）相比差异有统计学意义（p<0.05），与大肠癌分化程度，dukes分期，淋巴结转移及cea水平明显相关（p<0.05）。cyclind1和cdk4在大肠癌中阳性表达分别为26/47（55.5%）、28/47（59.6%），与正常组织中2/15（13.3%）、1/15（6.70%）及腺瘤组织中8/21(38.1%)、9/21（42.9%）相比呈递增趋势（p<0.05）。大肠癌中cyclind1阳性表达与肿瘤分化程度，dukes分期，淋巴结转移呈正相关（p<0.05），而与cea水平关系不大（p＞0.05）；cdk4阳性表达则与分化程度，dukes分期有关（p<0.05），与淋巴结转移及cea水平关系不密切（p＞0.05）。pkcα与cyclind1呈正相关关系（r=0.348,p<0.05），cyclind1和cdk4呈正相关关系（r=0.393,p<0.05），pkcα和cdk4则无明显相关性（r=0.167,p＞0.05）。结论 蛋白激酶cα与cyclind1及cdk4的过表达在大肠癌的发生、发展中起着重要的协同作用。三者的过表达与大肠癌的分化程度，dukes分期密切相关。
【关键词】 pkcα cyclind1 cdk4 免疫组织化学
真核生物细胞周期失控是细胞过度增殖及癌变的重要原因[1]。pkcα作为一种磷脂依赖性丝／苏氨酸蛋白激酶，可通过调节细胞周期g1期相关周期蛋白的水平而影响g1/s期的进程，从而参与细胞增殖、分化等生理病理过程。本研究从蛋白水平探讨pkcα,cyclind1和cdk4在大肠癌中表达的相关性及其与大肠癌临床病理学特征的关系。
1 资料与方法
1.1 标本
收集三峡大学第一临床医学院2004年3月～2006年3月间手术切除大肠癌标本47例，其中男32例，女15例。年龄23～76岁，平均年龄(53.2±1.76)岁。高中分化型33例，低分化型14例。有淋巴结转移22例，无淋巴结转移25例。dukes分期：a+b期25例，c+d期22例。另收集大肠腺瘤21例，正常大肠组织15例。所有患者术前均未行放疗和化疗。所有标本经10%中性福尔马林液固定，石蜡包埋，连续切片，行免疫组织化学染色。
1.2 免疫组化染色
采用免疫组化sp法，pkcα单抗购自武汉博士德生物工程有限公司。cyclind1、cdk4及sp试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司。pkcα、cyclind1、cdk4单抗均行微波抗原修复（温度92℃～98℃，持续20min），每批染色均设立阴性和阳性对照，免疫组化染色具体步骤按试剂盒说明进行。
1.3 结果判定
pkcα阳性着色定位于细胞浆；cyclind1阳性着色定位于细胞核；cdk4阳性着色定位于细胞核和细胞浆。以细胞中相应部位出现棕黄色颗粒为阳性细胞。参照fromowitz方法，在高倍镜下对细胞内反应如下评分：(1)无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；(2)阳性范围：<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～70% 为3分，>70%为4分。两项结果相加<2分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～ 5分为中度阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)。
1.4 统计方法
采用spss13.0统计软件，两两比较采用卡方检验，应用spearman等级相关对pkcα、cyclind1和cdk4在大肠癌中表达的相关性进行分析。以α=0.05为检验水准。
2 结果
2.1 pkcα在大肠正常组织、腺瘤及癌组织中的表达
pkcα主要定位于细胞浆，见图1。pkcα在大肠癌中阳性表达（31/47，66.0%）明显高于正常组织（3/15，20.0%）和腺瘤组织（10/21，47.6%），与后两者相比差异有统计学意义（p<0.05）。pkcα阳性表达与大肠癌分化程度低，dukes分期晚及淋巴结有转移，cea水平高密切相关（p<0.05）。
2.2 cyclind1、cdk4在大肠正常组织、腺瘤及癌组织中的表达
cyclind1以细胞核着色为主，见图2。cyclind1在大肠癌中阳性表达（26/47，55.3%）与正常组织（2/15，13.3%）及腺瘤组织（8/21，38.1%）相比，差异有统计学意义（p<0.05）。cyclind1阳性表达与大肠癌分化程度低，dukes分期晚及淋巴结转移显著相关（p<0.05），而与cea水平无密切关系（p>0.05）。
cdk4在细胞核及细胞浆均有着色，以细胞浆为主，见图3。cdk4在大肠癌中阳性表达（28/47，59.6%）与正常组织（1/15，6.7%）及腺瘤组织（9/21，42.9%）相比，差异有统计学意义（p<0.05）。cdk4阳性表达与大肠癌分化程度低，dukes分期晚关系密切（p<0.05），与淋巴结转移及cea水平关系并不密切（p>0.05）。
2.3 pkcα、cyclind1、cdk4在大肠癌组织中表达的相互关系
采用spearman等级相关分析表明，在大肠癌组织中，pkcα与cyclind1呈正相关（r=0.348，p<0.05），cyclind1与cdk4表达也呈正相关关系（r=0.393，p<0.05），而pkcα与cdk4无明显相关性（r=0.167，p>0.05）。
3 讨论
pkcα广泛分布于人体组织和细胞中，研究表 表1 pkcα、cyclind1、cdk4蛋白在正常大肠组织，腺瘤组织及癌组织中的表达表2 大肠癌组织中pkcα、cyclind1和cdk4蛋白表达的相互关系明pkcα在胃癌，肝癌，胰腺癌等多种癌组织中高表达，参与细胞增殖，抑制细胞凋亡和分化[2]。本实验通过检测pkcα在正常大肠组织、腺瘤及癌组织中的表达，发现在从正常组织向癌演变的过程中，pkcα的表达水平逐渐增加，且pkcα的高表达与肿瘤分化程度低，dukes分期晚，淋巴结转移及cea水平呈正相关。此结果表明pkcα的高表达在大肠癌发生、发展过程中可能具有重要作用。
cyclind1和cdk4结合形成cyclind1/cdk4复合物，使rb易感基因的蛋白产物磷酸化，失去抑制转录因子e2f的作用，e2f可启动dna合成，从而使细胞从g1期进入s期。cyclind1、cdk4 的过表达可引起细胞异常增殖、分化失控,最终导致肿瘤发生[3,4]。本实验cyclind1、cdk4在大肠癌中的表达高于正常组织、腺瘤组织，cyclind1阳性表达与肿瘤分化程度低，dukes分期晚及淋巴结转移明显相关，而cdk4则仅与肿瘤分化程度低，dukes分期晚关系密切。cyclind1和cdk4的高表达提示它们是大肠癌中常见的分子表现。
本实验中pkcα阳性表达与cyclind1呈正相关，cyclind1和cdk4呈正相关，而pkcα与cdk4关系不密切，推测可能是当pkcα过表达时通过mapk信号通路途径，作用于cyclind1启动子活性，从而导致cyclind1表达水平升高，cyclind1再通过与cdk4形成复合物从而调控细胞周期进程，表明pkcα与cyclind1及cdk4的过表达在大肠癌的发生发展中起着重要的协同作用。进一步弄清大肠癌pkcα信号通路与g1/s期调控点cyclind1及cdk4之间的关系，对探讨大肠癌发生发展机制具有积极意义。
【参考文献】
［1］ whittaker sr,walton mi,garrett md,et al．the cyclindependent kinase inhibitor cyc202(rroscovitine)inhibits retinoblastoma protein phosphorylation, causes loss of cyclin d1, and activates the mitogenactivated protein kinase pathway [j]．cancer res,2004,64(1)：262272．
[2] lahn m,patorsm bm,sundell k, et al. the role of protein kinase calpha(pkcα) in malignancies of the gastrointestinal tract[j]. eur j of cancer,2004,40(1):1020.
[3] yan kx, liu bc, shi xl,et al. role of cyclind1 and cdk4 in the carcinogenesis induced by silical[j]. biomed environ sci,2005,18(5):286296.
[4] reddy hk, mettus rv, rane sg,et al. cyclindependent kinase 4 expression is essential for neuinduced breast tumorigenesis1[j]. cancer res,2005, 65(22): 1017410178
