【摘要】 目的 研究胆囊腺癌、慢性胆囊炎和胆囊结石组织中kai1mrna和kiss1mrna表达水平及其临床病理意义。方法 108例胆囊腺癌、15例慢性胆囊炎和20例胆囊结石组织标本常规制作石蜡包埋切片，kai1mrna和kiss1mrna染色方法为原位杂交染色法。结果 胆囊腺癌组织中kai1mrna和kiss1mrna阳性表达率明显低于慢性胆囊炎和胆囊结石组织（p＜0.05，p＜0.01）；腺瘤癌变或高分化腺癌、肿块最大径≤3cm、无淋巴结转移及未侵犯周围组织的病例kai1mrna和kiss1mrna阳性表达率明显高于低分化腺癌或粘液腺癌、肿块最大径＞3cm、淋巴结转移及侵犯周围组织的病例（p＜0.05，p＜0.01）。结论 kai1mrna和kiss1mrna表达可能是反映胆囊腺癌发生、进展、转移或侵袭潜力及预后的重要生物学标记物。
【关键词】 转移抑制基因 信使rna 原位杂交
kai1和kiss1均为肿瘤转移抑制基因，其表达水平下降或缺失与许多恶性肿瘤的转移和预后密切相关[19]。国内外尚未见胆囊腺癌及其良性病变组织中kai1mrna和kiss1mrna表达水平研究的文献报道。本文应用原位杂交染色法研究108例胆囊腺癌、15例慢性胆囊炎和20例胆囊结石组织中kai1mrna、kiss1mrna表达水平，探讨两者与胆囊癌临床病理特征的关系及其生物学意义。
1 资料与方法
1.1 临床病理资料
收集本院、湘雅医院和湖南省人民医院1996年6月～2006年6月胆囊癌切除手术标本108例，男31例（28.7％），女77例（71.3％）。病理类型均为腺癌，其中腺瘤癌变9例（8.2％），高分化腺癌29例（26.9％），中分化腺癌29例（26.9％），低分化腺癌30例（27.8％），粘液腺癌11例（10.2％）；侵犯胆囊外周围组织器官59例（54.6％）；共有59例发生区域淋巴结转移（54.6％）；58例伴有胆囊结石（53.7％）；手术方式包括根治性切除34例（31.5％），姑息手术48例（44.4％）和因广泛转移不能手术26例（24.1％）。另收集15例慢性胆囊炎和20例胆囊结石组织标本作为对照。上述标本经4％甲醛固定后常规制作石蜡包埋，切片厚4μm。
1.2 主要试剂
kai1mrna和kiss1mrna原位杂交染色试剂盒购自武汉博士德公司，dabhcl显色试剂盒购自北京中杉生物技术公司。
1.3 方法
kai1mrna和kiss1mrna染色方法均为原位杂交染色法，其具体步骤如下：（1）石蜡切片经常规脱蜡至水化；（2）3％过氧化氢甲醇液15min，水洗；（3）胃蛋白酶消化10min，水洗；（4）预杂交液42℃ 2h；（5）杂交液42℃杂交过夜；（6）杂交后洗涤，2×ssc洗涤5min×2次，0.5×ssc洗涤5min×2次，0.2×ssc洗涤5min×2次；（7）5％小牛血清封闭液37℃ 20min；（8）生物素化鼠抗地高辛37℃ 1h，原位杂交专用pbs洗涤5min×3次；（9）abc液37℃ 30min，原位杂交专用pbs洗5min×3次；（10）滴加生物素化过氧化物酶37℃ 20min，原位杂交专用pbs洗5min×3次；（11）dabhcl显色液显色20min，蒸馏水洗涤；（12）苏木素复染1min，自来水返蓝15min；（13）酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。胞浆中出现明显棕黄色颗粒者为阳性细胞，以切片中阳性细胞率≥25％为阳性病例，＜25％者为阴性病例。以原位杂交试剂盒内阳性切片作为阳性对照，以原位杂交专用pbs液替代杂交液作为阴性对照。
1.4 统计学处理
将所得数据输入spss11.0统计软件包中，进行χ2检验、fisher精确概率法，检验水准α＝0.05。
2 结果
2.1 kai1mrna、kiss1mrna在胆囊腺癌、慢性胆囊炎及胆囊结石组织中的表达
108例胆囊腺癌kai1mrna和kiss1mrna表1 kai1mrna和kiss1mrna表达与胆囊癌临床病理特征的关系*：低分化腺癌与腺瘤癌变比较，pkai1mrna＝0.023，pkiss1mrna＝0.005;粘液腺癌与腺瘤癌变比较，pkai1mrna＝0.035，pkiss1mrna＝0.025;低分化腺癌与高分化腺癌比较，χ2kai1mrna＝7.49、p＜0.01,χ2kiss1mrna＝10.75、p＜0.01；粘液腺癌与高分化腺癌比较，χ2kai1mrna＝5.67、p＜0.05，χ2kiss1mrna＝5.46、p＜0.05；中分化腺癌与腺瘤癌变比较，pkiss1mrna＝0.034阳性表达病例分别为56例（51.9％）和58例（53.7％），15例慢性胆囊炎组织两者阳性表达病例均为13例（86.7％），20例胆囊结石组织两者阳性表达病例均为17例（85.0％）；胆囊腺癌kai1mrna和kiss1mrna阳性表达率均明显低于慢性胆囊炎（χ2kai1mrna＝6.48，p＜0.05；χ2kiss1mrna＝5.86，p＜0.05）和胆囊结石组织（χ2kai1mrna＝7.57，p＜0.01；χ2kiss1mrna＝6.81，p＜0.01）。
2.2 kai1mrna、kiss1mrna表达与胆囊癌临床病理特征的关系
腺瘤癌变或高分化腺癌、肿块最大径≤3cm、无淋巴结转移及无周围组织侵犯病例kai1mrna和kiss1mrna阳性表达率明显高于低分化腺癌、肿块最大径＞3cm、有淋巴结转移及有周围组织侵犯的病例，差异均有统计学意义（p＜0.05，p＜0.01）；粘液腺癌kai1mrna阳性表达率明显低于腺瘤癌变（p＝0.005）和高分化腺癌（χ2＝5.67，p＜0.05），粘液腺癌kiss1mrna表达阳性率明显低于腺瘤癌变（p＝0.025）；两者表达与患者性别、年龄及有无胆囊结石等其他临床病理特征均无明显关系（p＞0.05），见表1。
3 讨论
kai1基因属于跨膜超家族成员4(tm4sf)之一，是较公认的肿瘤转移抑制基因。研究显示，kai1及其mrna表达水平与恶性肿瘤进展、转移发生、恶性程度及预后密切相关，阳性表达者进展慢、转移发生率低、恶性程度低及预后较好。其机制可能是kai1基因高度表达对恶性肿瘤进展及转移发生起抑制作用,一旦无法保持kai1基因的高水平表达，则促使肿瘤进入进展期，进而发生转移[14]。本组资料发现，胆囊腺癌kai1mrna阳性表达率明显低于慢性胆囊炎及胆囊结石组织；胆囊腺瘤癌变或高分化腺癌、肿块最大径≤3cm、无淋巴结转移及未侵犯胆囊外周围组织者kai1mrna阳性表达率明显高于低分化腺癌、粘液腺癌、肿块最大径＞3cm、淋巴结转移及侵犯周围组织者。其结果与国外文献报道较一致，说明kai1mrna表达水平是反映胆囊癌进展、生物学行为、转移潜能及预后的重要生物学标记物。
kiss1是1996年发现的肿瘤转移抑制基因，它的cdna编码一个145个氨基酸的亲水蛋白质，存在富集脯氨酸的结构域，可能是src癌基因蛋白的同源3号区（src homology3, sh3）的配体，提示kiss1可能抑制带有sh3的各种因子参与肿瘤转移级联反应，从而抑制肿瘤转移[59]。较多学者应用rtpcr、原位杂交及免疫组化等方法发现一系列恶性肿瘤（如胃癌、食管癌、膀胱癌等）存在kiss1基因失活，kiss1mrna及其蛋白表达水平与一些恶性肿瘤进展、转移发生等临床病理参数密切相关，其表达水平提供了良好的预后信息，阳性或高水平表达者多进展慢、恶性程度低、不易发生转移及预后好[59]。本组资料显示，胆囊腺癌kiss1mrna阳性表达率明显低于慢性胆囊炎及胆囊结石组织；在胆囊腺癌中，腺瘤癌变或高分化腺癌、肿块最大径≤3cm、无淋巴结转移及周围组织未侵犯病例kiss1mrna阳性表达率明显高于低分化腺癌或粘液腺癌、肿块最大径＞3cm、淋巴结转移及侵犯周围组织病例。其结果与国外学者在其他恶性肿瘤中的报道较一致，kiss1mrna可作为胆囊腺癌评估转移潜力及预后的重要生物学标记物之一。
【参考文献】
［1］ leavey pj, timmons c, frawley w, et al. kai1 expression in pediatric highgrade osteosarcoma [j]. pediatr dev pathol, 2006,9(3):219224.
[2] ito y, uruno t, takamura y, et al. papillary microcarcinomas of the thyroid with preoperatively detectable lymph node metastasis show significantly higher aggressive characteristics on immunohistochemical examination [j]. oncology, 2005,68(23):8796.
[3] guo xz, friess h, shao xd, et al. kai1 gene is differently expressed in papillary and pancreatic cancer: influence on metastasis [j]. world j gastroenterol, 2000,6(6):866871.
[4] kim jh, kim b, cai l, et al. transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by tip60 and betacatenin complexes [j]. nature, 2005,434(7035):921926.
[5] martin ta, watkins g, jiang wg, et al. kiss1 expression in human breast cancer [j]. clin exp metastasis, 2005,22(6):503511.
[6]dhar dk, naora h, kubota h, et al. downregulation of kiss1 expression is responsible for tumor invasion and worse prognosis in gastric carcinoma [j]. int j cancer, 2004,111(6):868872.
[7]takino t, koshikawa n, miyamori h, et al. cleavage of syndecan1 by membrane type matrix metalloproteinase1 stimulates cell migration [j]. j biol chem, 2003,278(42):4076440770.
[8] ikeguchi m, yamaguchi k, kaibara n. clinical significance of the loss of kiss1 and orphan gproteincoupled receptor (hot7t175) gene expression in esophageal squamous cell carcinoma [j]. clin cancer res, 2004,10(4):13791383.
[9]sanchezcarbayo m, capodieci p, cordoncardo c. tumor suppressor role of kiss1 in bladder cancer: loss of kiss1 expression is associated with bladder cancer progression and clinical outcome [j]. am j pathol, 2003,162(2):609617.
