摘要】  ［目的］ 研究pten 和c-erbb-2基因在原发性胆囊癌（pgc）中的表达及其意义。［方法］ 应用原位杂交（dna-rna）技术与免疫组化sp法分别检测64例pgc中pten mrna、pten蛋白和c-erbb-2蛋白的表达。以22例胆囊腺瘤及10例慢性胆囊炎作为对照。［结果］pten mrna和蛋白在pgc组织中的阳性表达率(56.3%，59.4%)均明显低于胆囊腺瘤组织（81.8%，90.8%）和慢性胆囊炎组织(100%，100%)(p＜0.05)。c-erbb-2蛋白在pgc组织中的阳性表达率(46.8%)均明显高于胆囊腺瘤组织(9.1%)和慢性胆囊炎组织(0)（p＜0.05）。［结论］ pten低表达和c-erbb-2高表达共同参与了pgc的发生发展，其蛋白可作为判断pgc预后的指标。

【关键词】  胆囊肿瘤

    expression of pten and c-erbb-2 in 64 cases with primary gallbladder carcinoma

    huang ying1, wan hui-bin2, zheng chang-li3

    （1.the primary department of medical in changde vacational technical college, changde 415000, china; 2.the hospital of womens prison in chang-bei, nanchang 330038, china; 3.the pathology department in xiangya hospital of centre-south university, changsha 410000, china)

    abstract: ［purpose］ to study the expression of pten and c-erbb-2 in primary gallbladder carcinoma(pgc) and its significance. ［methods］ the expression of pten mrna, pten protein and c-erbb-2 protein were detected by in situ hybridization(dna-rna)  and immunochemistry(sp method) in 64 cases with pgc, 22 cases with gallbladder adenoma and 10 cases with chronic cholecystitis as controls. ［results］ the positive expression rates of pten mrna and pten protein in pgc(56.3%,59.4%) were significantly lower than those in gallbladder adenoma (81.8%,90.8%) and chronic cholecystitis(100%,100%)(p＜0.05）. the positive expression rate of c-erbb-2 protein in pgc(46.8%) was significantly higher than that in gallbladder adenoma (9.1%) and chronic cholecystitis (0)(p＜0.05）. ［conclusion］ low expression of pten and high expression of c-erbb-2 both play an important role in oncogenesis of pgc. they may be uses as markers for prognosis evaluation.

    key words: gallbladder neoplams；c-erbb-2；pten；immunochemistry；in situ hybridization

    近年来,与原发性胆囊癌（primary gallbladder carcinoma，pgc）发生有关的癌基因、抑癌基因不断被发现[1]。抑癌基因-10号染色体上缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，pten），于1997年由li等[2]发现。目前研究发现pten蛋白主要有以下功能：①pten促进细胞阻滞在g1期[3]，②pten诱导细胞凋亡[4]，③pten抑制细胞的迁移与黏附[5]。若pten发生突变或缺失,则失去抑癌作用，且在恶性肿瘤中有低水平表达。突变的c-erbb-2与多种肿瘤的发生发展密切相关。本文有关胆囊癌中pten基因与c-erbb-2基因的研究，旨在探讨pten基因和c-erbb-2基因与pgc发生发展的关系。

    1   材料与方法

    1．1   研究对象

    64例原发性胆囊癌、22例胆囊腺瘤及10例慢性胆囊炎组织均为1996年~2004年中南大学湘雅医院附一院外科手术切除标本，均有完整的临床及病理资料，所有标本经10%formalin 固定，石蜡包埋，5μm连续切片，病理诊断分别为原发性胆囊癌（pgc）、胆囊腺瘤及慢性胆囊炎。64例原发性pgc根据nevin标准[6]病理分级：其中sⅰ~ⅱ级28例（ⅰ级10 例，ⅱ级18例），sⅲ~ⅳ级36例（ⅲ级14例，ⅳ级22例）；远处转移36例，淋巴结转移34例；男性24例，女性40例。29~49岁14例，50~59岁24例，60岁26例，平均年龄 55（29~81）岁。

    1．2   主要试剂

    免疫组化试剂：兔抗pten及兔抗c-erbb-2单克隆抗体为福州迈新生物技术有限公司，sp试剂盒（通用型）为福州迈新生物技术有限公司。

    原位杂交试剂：pten原位杂交试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品。

    1．3   方   法

    1．3.1   免疫组化sp法

    甲醇阻断，微波处理进行抗原修复，滴加一抗，4℃孵育过夜，滴加二抗，孵育，滴加streptavidin-peraxidase，溶液显色，苏木素复染，镜下观察。阴性对照：用pbs缓冲液分别代替pten、c-erbb-2一抗或二抗，其它步骤同实验组。阳性对照：pten、c-erbb-2用已知抗pten抗体、抗c-erbb-2抗体阳性的乳腺癌组织作为阳性对照。

    1．3.2   原位杂交（dna-rna）方法

    甲醇阻断，胃蛋白酶消化，双蒸水洗，加预杂交液，40℃×2h，加杂交液，40℃，过夜，梯度ssc液洗，加生物素化鼠抗地高辛，滴加sabc，加生物素化过氧化物酶，dab溶液显色，苏木素复染，镜下观察。

    阴性对照：用不含探针的预杂交液替代含pten寡核苷酸探针杂交液，其他步骤同实验组。阳性对照：用已知pten mrna阳性的乳腺癌组织作为阳性对照。

    1．3．3   结果判断标准

    pten mrna和pten 蛋白表达均以细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性，c-erbb-2蛋白以胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性，并参照fromowitz等[7]提出的方法，稍加改进作半定量分析：每张切片随机观察5个高倍视野，每个视野计数100个细胞，各视野中阳性细胞数的平均百分数作为该切片的阳性细胞百分比进行计分。＜5%计为0分；5%~25%计为1分；26%~50%计为2分；51%~75%计为3分；>75%计为4分。染色强度以多数阳性细胞呈现的染色特征为标准计分。细胞未着色为0分，染色呈淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。最后以阳性细胞的百分比和染色强度计分之和所得的总分进行结果判定。0~1分为阴性（-），2~3分为弱阳性（+），4~5分为中度阳性（++），6~7分为强阳性（+++）。

    1.4   统计学分析

    采用χ2检验，以p<0.05确定差异有显著意义。数据用spss统计软件包进行处理。

    2   结   果

    2．1   pten蛋白表达

    pten蛋白阳性信号呈棕黄色、棕褐色，以胞质型为主，少数核阳性。pgc组织中阳性细胞呈片状分布，呈弱阳性全浆型、膜下型表达（图1），阳性率59.4%（38/64）；慢性胆囊炎组织中pten蛋白呈弥漫性强阳性全浆型表达，阳性率100%（10/10），而胆囊腺瘤组织呈阳性全浆型表达，阳性率90.8（20/22）。表1所示，pgc组织中pten蛋白阳性表达率明显低于腺瘤组织和炎症组织（p<0.05）。

    2．2   pten mrna表达

    pten mrna表达形式和表达强度均与pten蛋白相似（图2）。pgc癌组织中pten mrna阳性率为56.3%（36/64），胆囊腺瘤组织中阳性率为81.8%（18/22），后者显著高于前者（p<0.05）。慢性胆囊炎组织阳性率为100%（10/10）。

    2．3   c-erbb-2蛋白表达

    pgc中c-erbb-2阳性信号主要定位于胞膜和胞浆，呈强阳性表达；胆囊腺瘤中主要定位于胞浆，呈弱阳性表达（图3），慢性胆囊炎组织未见着色。64例pgc癌组织中c-erbb-2蛋白阳性为30例，阳性率为46.8%（30/64），22例胆囊腺瘤c-erbb-2蛋白阳性2例，阳性率为9.1%（2/22），前者显著高于后者（p<0.05）。10例慢性胆囊炎组织中未见阳性表达。

    3   讨   论

    pten是具有磷酸脂酶活性的抑癌基因。其基因序列分析表明，pten第5外显子是其重要的功能域，它编码的序列与酪氨酸磷酸酶催化区的核心基因和双特异性的保守区高度同源，其编码的双特异性磷酸酶可使丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基去磷酸化[8]。pten的磷酸酶活性是其抑制细胞生长的前提和条件[9]，该编码区基因的突变可能与肿瘤的发生密切相关。whang等[10]发现pten mrna在前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌等表达下调。li等[11]发现肿瘤细胞中pten mrna表达水平显著降低。本研究显示pgc中pten mrna和pten蛋白的阳性表达率和阳性信号均明显低于胆囊腺瘤和慢性胆囊炎组织。本研究结果显示pten mrna和pten蛋白的表达呈现逐渐下调，提示pten基因的突变或/和缺失可能与pgc发生发展有关。

    癌基因c-erbb-2又称neu或her-2基因。其结构和功能与表皮生长因子受体（egfr）有高度的相似性。通过c-erbb-2基因对一系列激活因子的应答，细胞和组织生长、分化得到一定的调节。在体内外某些致癌因子作用下，c-erbb-2基因被激活，主要表现为基因扩增及其蛋白产物的过度表达。突变后的c-erbb-2蛋白，在细胞膜上以凝聚形式存在，增加与细胞转化有关的酪氨酸激酶活性，刺激细胞生长，促进癌瘤的发生。kamel等[12]研究结果提示c-erbb-2基因扩增和蛋白产物高表达是胆囊癌晚期表现，与肿瘤的浸润有关。chow等[13]报道胆囊癌中c-erbb-2过度表达率达63.6%。本组64例胆囊癌中c-erbb-2蛋白阳性率为46.8%，胆囊腺瘤组织中阳性率仅为9.1%，慢性胆囊炎组织中则均为阴性，提示原癌基因c-erbb-2的扩增参与胆囊癌发生过程。故c-erbb-2蛋白过度表达对判断预后有重要的临床意义。

【参考文献】
  [1] 吴辉, 陈训如. 胆囊癌相关基因研究进展[j]. 肿瘤, 1999, 8（6）:286-289.

[2] li j, yen c, liaw d, et al. pten, a putative potein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain, breast, and prostate cancer[j].science,1997,275（5308）:1943-1947.

[3] wu rc, li x, schontha1 ah. transcriptional activation of p21waf1 by pten/mmac1 tumor suppressor[j].mol cell biochem, 2002, 203（1-2）:59-71.

[4] carson jp, kulik g, weber mj. antiapoptotic signaling in prostate cancer cells: a survival signaling pathway, independent of phosphatidy linositol 3’-kinase and akt/protein kinase b[j]. cancer res, 1999, 59(7):1449-1453.

[5] 杨海伟, 霍霞, 徐锡金. pten基因和肿瘤[j]. 国外医学生理病理科学与临床分册, 2001, 21（2）:117-119.

[6] 吴阶平, 裘法祖. 黄家驷外科学[m]. 第6版. 北京:人民卫生出版社, 1991. 78-79.