【摘要】 目的 利用rnai技术特异性的抑制nfκb亚单位p65的表达，探讨在食管鳞癌细胞中将nfκb作为基因治疗靶点的价值。方法 将荧光素标记的对照sirna转染到食管鳞癌细胞中观察转染效率，p65 sirna转染到ec9706和eca109细胞中，使用western blot的方法检测p65 和cyclin d1蛋白的表达，使用emsa法检测转染前后p65与dna结合活性的变化;流式细胞仪检测p65 sirna与5fu(327μg/ml)单独或联合应用，对食管鳞癌细胞周期的影响。结果 荧光素标记的sirna转染食管鳞癌细胞的效率可达90%以上。在转染后的ec9706和eca109细胞中，p65和cyclin d1蛋白的表达水平下调; nfκb与dna的结合活性明显下降;g0/g1期的细胞开始增加，同时s期的细胞逐渐减少;当转染p65 sirna细胞联合使用5fu时，g0/g1期的细胞明显增加，同时s期的细胞明显减少。结论 p65 sirna可以特异性的阻断nfκb信号通路，下调nfκb下游基因中细胞周期蛋白cyclin d1的表达，表明活化的nfκb信号通路可以成为食管鳞癌基因治疗中一个重要的分子靶点。
【关键词】 食管鳞癌;nfκb;rna interference;cyclin d1
effect of sirnamediated inhibition of nfκb combination with 5fu on cell cycle of escc cell lines
tian fang1，2，chai yurong3，xu peirong2，liu hongtao2，xue lexun2
1. department of pathophysiology, basic medical college of zhengzhou university, zhengzhou 450052, china，2. laboratory for cell biology，3. department of histology and embryology
corresponding author：xue lexun，email：[email protected]：objective rna interference (rnai) was employed to inhibit the expression of p65 and to evaluate the effects of nfκb signaling pathway as a target for gene therapy in escc cell lines. methods a fluoresceinlabeled nonspecial sirna was used to monitor efficiency in ec9706. ec9706 and eca109 were transfected with 50 nm p65sirna, p65 and cyclind1 protein levels were determined using western blotting. after transfected with or without p65sirna at 72h, cells were tested for nuclear activity of nfκb using nuclear extracts by emsa. escc cells were treated with or without p65sirna, 5fu or combinations thereof for 48h. the cells were stained with pi and analyzed cell cycle by flow cytometry. results a fluoresceinlabeled nonspecial sirna was used to monitor efficiency in ec9706, demonstrating nearly 90% transfection efficiency. the protein level of p65 and cyclind1 decreased after transfected with p65sirna at 72h. and p65sirna also suppressed the nfκbdnabinding. p65sirnatransfected cells showed an increase in the percentage of cells in the g0/g1 phase and a decrease in the percentage of cells in the s phase. while combination with 5fu, the results were more prominence. conclusion p65sirna inhibits the constitutively active nfκb signaling pathway, and downregulats the expression of cyclind1. the strong constitutive nfκb signaling pathway in escc makes nfκb a target for the development of novel therapeutic strategies.
key words：esophageal squamous cell carcinoma;nfkappab;rna interference;cyclin d1
食管鳞癌是一种侵袭性很强的肿瘤，它的预后差，临床进展迅速，多伴有淋巴结转移，且易复发。核因子nfκb (nuclear factorkappa b) 是近年来发现的转录调控因子，最常见的形式是由 p50 和p65组成的异源二聚体，在绝大多数静止期的细胞中，nfκb 与其阻抑物iκbα蛋白相结合，以非活性形式存在于细胞质中。许多刺激物可以通过对iκbα的磷酸化而使其降解，使解离的nfκb进入到核内并暴露它的核识别位点，从而促进靶基因的转录。活化的nfκb信号通路可增强肿瘤细胞对放化疗药物的抵抗力，从而产生耐药性。有研究表明，在许多人类肿瘤中nfκb信号通路的激活在肿瘤的发生发展中起着重要的作用[13]。
rna干扰(rna interference，rnai)是由双链rna(doublestranded rna，dsrna)引发的转录后基因静默机制，是目前研究基因功能强有力的工具之一[4]。rnai 的功能是由21～23 个碱基长的短双链rna完成的 ,即sirna(small interference rna ,sirna)，它具有与目的基因互补的序列。目前这一方法被用于体外细胞水平的基因敲除或基因表达抑制,为其成为基因治疗的手段开辟了广阔的前景。本研究拟应用rna干扰技术，使用针对nfκb信号通路中p65的特异性sirna,观察其对p65表达的抑制作用及联合化疗药5fu对食管鳞癌ec9706和eca109细胞周期的影响，探讨将nfκb作为基因治疗靶点的价值。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞系及细胞培养 食管癌细胞系eca109由本室保存，食管癌细胞系 ec9706由中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室惠赠。两株细胞在含有10%的胎牛血清，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素的1640培养液(gibco公司)中于37 ℃、5% co2 的条件下培养，实验细胞均处于对数生长期。
1.1.2 抗体和试剂 鼠抗人p65(sc8008)单克隆抗体和兔抗人cyclin d1(sc753)购自santa cruz biotechnology 公司;细胞核和细胞质蛋白提取试剂盒、生物素3′末端标记试剂盒(89818)、化学发光emsa 试剂盒(78833)均购自 pierce 公司。nfκb p65 sirna干扰试剂盒购自cell signaling technology公司，碘化吡啶pi购自美国sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 sirna的转染及效率检测 按照cell signaling technology公司sirna干扰试剂盒说明书的要求，进行转染。在转染前，ec9706(5×104) 和eca109(6×104)按一定细胞数铺于6孔板中，使用无抗生素的培养基培养24h。将含有sirna的转染试剂或荧光素标记的对照sirna与细胞共孵育5h后，加入新鲜培养基孵育24h。用日本nikon公司显微荧光摄像/照相系统检测荧光素标记的对照sirna在ec9706细胞中的转染效率并照相。
1.2.2 胞浆、胞核蛋白的制备 按照细胞核和细胞质蛋白提取试剂盒说明书，分别提取细胞质、细胞核蛋白，bradford 法检测蛋白质的含量，-70℃保存。
1.2.3 western blot测定蛋白的表达 转染p65sirna72h后，从ec9706和eca109细胞中取细胞质蛋白，与预染的蛋白质分子量标准一起上样。检测p65和非靶向mapk蛋白表达，及细胞周期蛋白cyclin d1的表达，经12%sdspage分离，电转到硝酸纤维膜上。5%的脱脂奶粉tbst溶液封闭2h，抗体按1∶100 孵育4℃过夜，tbst溶液洗涤10min×3次，硝酸纤维膜分别与辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶50 000)室温孵育1h后，tbst溶液洗涤10min×3次，dab显色。实验重复三次。
1.2.4 凝胶电泳迁移率(electrophoretic mobility shift assay，emsa)检测nfκb与 dna的结合活性 ec9706和eca109细胞转染p65sirna 72h后，收集转染细胞和未转染细胞提取细胞核蛋白，检测转染前后p65与dna结合活性的变化，方法如下：采用生物素3′末端标记法将nfκb探针5′agt tga ggg gac ttt ccc agg c3′，3′tca act ccc ctg aaa ggg tcc g5′进行标记。将细胞核提取物(10μg)与生物素标记的探针在20μl的缓冲液(10m trishcl，ph 8.5，0.5 mm edta，5mm mgcl2，1m kcl，0.05% np40，2.5% glycerol，1μg/μl poly (di·dc) and 0.2μg/μl bsa)中充分结合，行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，采用毛吸转移法转移至带正电荷的尼龙膜上，120mj紫外交联5min。生物素标记的dna探针与hrp标记的亲和素之间相结合，通过化学发光，显影，定影。
1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期 转染和未转染p65 sirna的食管鳞癌细胞，在50ml培养瓶中培养，5fu单独或联合应用，进行试验分组和处理，作用48h后，收集细胞;1 000 r/min离心5min，弃去上清;用pbs洗两遍，离心后弃去，加入70%冰乙醇固定，4℃过夜;上机前，1 000 r/min离心5min，弃去乙醇，pbs洗三遍;加入1ml pbs制成细胞悬液，加rnasea(终浓度50μg/ml)，室温放置1h;调整细胞浓度为1×106，加1ml pi(100μg/ml)，避光30min，上机检测细胞周期，每个样本检测10 000个细胞。
2 结果
2.1 sirna转染食管鳞癌细胞ec9706的效率
将荧光素标记的对照sirna，在同样条件下转染到ec9706细胞中，置37℃、5%co2孵育箱内培养48h，通过荧光显微镜观察转染效率，见图1。sirna转染食管鳞癌细胞的效率可达90%以上。
2.2 食管鳞癌细胞转染p65sirna后p65蛋白的表达水平
western blot检测细胞中p65的蛋白表达水平，见图2。结果表明，与未转染p65 sirna的ec9706和eca109细胞相比，转染后的ec9706和eca109细胞，p65蛋白的表达水平下调，而非靶向蛋白mapk的表达无影响。
2.3 食管鳞癌细胞转染p65sirna后，nfκb与κb位点结合活性的改变
ec9706和eca109细胞转染p65sirna72h后，收集各组细胞提取细胞核蛋白，emsa检测nfκb与dna结合活性的变化。结果发现，与未转染p65 sirna的ec9706和eca109细胞相比，转染p65 sirna的ec9706和eca109细胞中，nfκb与dna的结合活性明显下降，见图3。提示：p65 sirna可以抑制p65的表达，下调nfκb与靶基因的结合活性。
2.4 p65sirna阻断nfκb信号通路下调cyclind1的表达
食管鳞癌细胞ec9706和eca109在转染p65 sirna72h后，分别提取细胞总蛋白检测细胞周期cyclin d1蛋白的表达情况。结果表明，与未转染的细胞相比，cyclin d1的表达在转染72h后开始下降，见图4。
2.5 p65sirna单独或联合5fu对食管鳞癌ec9706和eca109细胞周期的影响
食管鳞癌细胞ec9706和eca109按以下方法分组：未转染组;转染p65 sirna72h组;单独使用5fu组;转染p65 sirna48h后，使用5fu治疗24h组。各组细胞使用pi染色，以未转染组为对照，检测细胞周期变化情况。结果显示，ec9706和eca109在转染p65 sirna后，g0/g1期的细胞开始增加，同时s期的细胞逐渐减少;当转染细胞联合使用5fu时，g0/g1期的细胞明显增加，同时s期的细胞明显减少，见表1、2。
3 讨论
研究表明，活化的nfκb信号通路存在于多种人类肿瘤中，作者以往的研究已证实在两种食管鳞癌细胞中存在有激活的nfκb信号通路[5]。但是，激活的nfκb信号通路在食管鳞癌细胞的增殖及对化疗药的耐受性等机制中是否起作用，尚不清楚。本研究使用rna干扰技术，特异性的阻断nfκb亚单位p65的表达，研究nfκb信号通路在食管鳞癌的发生发展中的作用。western blot实验中，将终浓度为50nm的p65 sirna分别转染ec9706和eca109细胞，持续作用72h，检测p65的蛋白表达水平，结果发现，在转染72h后，与未转染细胞相比，p65的蛋白表达水平也明显下降，而非靶向抗体mapk的表达水平未受到影响。表1 p65 sirna转染前后与5fu单独或表2 p65 sirna转染前后与5fu单独或联合
活化的nfκb可以进入到核内，与下游调控基因上共同的κb序列结合，参与细胞的增殖、转化、浸润及抗凋亡。抑制nfκb信号通路的活性，最终是抑制nfκb与κb的序列结合，阻断它促进下游基因表达的功能。本研究采用凝胶滞留实验检测nfκb与dna的结合，结果发现，在转染72h后，nfκb与dna的结合活性明显下降。以上实验结果表明，p65 sirna可以高效的转染到食管鳞癌细胞中，特异性的抑制目的基因p65在mrna和蛋白水平上的表达，导致nfκb与dna结合能力下降，从而抑制nfκb信号通路的活化。
cyclin d1的高表达存在于多种肿瘤中，如mega等[6]的研究发现，在食管鳞癌组织中，cyclin d1和e2f1的高表达会促进肿瘤的发展，导致病人的预后欠佳。在研究中国南方的食管癌组织中发现，cyclin d1的高表达存在于61%的样本中，提示cyclin d1的表达是食管癌发生的早期事件，并在肿瘤的进展中cyclin d1的表达不断积累[7]。本研究采用western blot法，检测转染p65sirna，阻断nfκb信号通路后，是否能够下调nfκb下游基因cyclin d1的表达。将终浓度为50nm的p65 sirna分别转染ec9706和eca109细胞，72h后收集细胞总蛋白，结果发现，与未转染细胞相比，转染细胞中cyclin d1的表达受到抑制。本研究还采用流式细胞仪检测食管鳞癌细胞在转染前后及单独或联合应用5fu后，对细胞周期的影响。ec9706和eca109在转染p65 sirna后，g0/g1期的细胞开始增加，s期的细胞逐渐减少;当转染细胞联合使用5fu时，g0/g1期的细胞明显增加，同时s期的细胞明显减少。以上这些结果表明，由于cyclin d1是细胞周期进行中一个重要的调节者，当使用p65 sirna阻断食管鳞癌细胞中nfκb信号通路时，cyclin d1的表达下调，肿瘤细胞被停滞在g1期，提示cyclin d1是受nfκb调节的一个重要的下游基因，nfκb可以通过对cyclin d1的调控来促进食管鳞癌细胞的增殖。p65 sirna阻断食管鳞癌细胞中nfκb信号通路并联合使用5fu，可以明显抑制食管鳞癌细胞的增殖，使更多细胞停滞在g1期，减少细胞的分裂。
因此，激活的nfκb信号通路在食管鳞癌细胞的增殖及耐药中起着重要的作用，通过转染p65 sirna可以特异性的阻断nfκb信号通路，抑制食管鳞癌细胞的增殖，增加细胞对化疗药的敏感性，提示nfκb信号通路可以成为食管癌基因治疗中一个强有力的作用靶点。
【参考文献】
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[4] takahashi y, nishikawa m, kobayashi n, et al. gene silencing in primary and metastatic tumors by small interfering rna delivery in mice: quantitative analysis using melanoma cells expressing firefly and sea pansy luciferases[j]. j control release, 2005, 105(3):332343.
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