【摘要】 目的：研究三磷酸腺苷结合盒转运体a1(abca1)基因r219k多态性对血脂水平及辛伐他汀调脂治疗的影响。方法：原发性高脂血症患者80例，给予辛伐他汀20mg/d，治疗8周，治疗前后测定患者血清总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、低密度脂蛋白胆固醇(ldlc)及高密度脂蛋白胆固醇(hdlc)浓度，治疗期间进行不良反应的监测。使用taqman荧光探针技术测定患者abca1基因r219k多态性。根据不同的基因型分组，比较不同基因型之间血脂水平变化的差异。进而判定不同基因型对血脂水平及辛伐他汀疗效的影响。结果：abca1 r219k基因存在三种基因型，即rr、rk和kk基因型。辛伐他汀治疗前rr基因型和rk基因型hdlc水平明显低于kk基因型(p<0.05)。辛伐他汀治疗8周后，三种基因型tc、tg、ldlc水平均较前降低，hdlc水平均较前升高;治疗后rr及rk基因型hdlc水平仍低于kk型(p<0.05); 但tc、tg、ldlc和hdlc水平的变化在不同基因型组之间无显著差异( p> 0.05)。结论：abca1基因r219k单核苷酸多态性可影响hdlc水平，k等位基因与高hdlc水平相关，但与辛伐他汀治疗的个体差异性无关。
【关键词】 atp结合匣式转运体;多态性，单核苷酸;辛伐他汀
association of abca1 r219k polymorphism with therapeutic effects of simvastatin
jiang hongyan, li ruijie, li li
abstract：objective:to investigate the interactions between r219k polymorphisms in atpbinging cassette(abc)a1 gene and the plasma lipid levels, and to compared therapeutic effect of simvastatin in different genotypes.methods:eighty hypercholesterolemic patients were included in this study.subjects entering the study were treated with 20 mg/d simvastatin for 8 weeks. levels of serum total cholesterol (tc), triglyceride (tg), low-density lipoprotein cholesterol (ldlc) and highdensity lipoprotein cholesterol (hdlc) were measured before treatment and after 8 weeks of treatment.abca1 gene polymorphism in patients was detected by taqman technology.results:three genotypes were detected in r219k single nucleotide polymorphism of abca1 gene in our study.there were significant differences among abca1 r219k genotypes in hdlc levels before therapy(p<0.05).the individuals with the rr/rk genotypes had a lower hdlc level than that of the kk genotype (p<0.05).after treatment of simvastatin for 8 weeks, all the levels of tc, tg and ldlc decreased and the value of hdlc increased than before treatment. the rr/rk genotypes still had a lower hdlc level than kk genotype(p<0.05), but no significant differences was found about the change of tc, tg, ldlc and hdlc levels in different genotypes to simvastatin ( p> 0.05).conclusion:abca1 r219k single nucleotide polymorphisms significantly influences the plasma levels of hdlc, kk gene may be associated with higher hdlc level.no association was found between different genotypes and the change of plasma lipids levels.
key words：transporters,atpbinging cassette;polymorphism,single nucleotide;simvastatin
他汀类药物可通过明显降低血浆胆固醇(tc)及低密度脂蛋白胆固醇(ldlc)水平并且升高高密度脂蛋白胆固醇(hdlc)，从而有效地预防及治疗动脉粥样硬化 [1]。研究发现，他汀类药物在调脂治疗中有显著的个体差异性，而这种个体差异性与药物吸收到代谢过程中所涉及的药物代谢酶、转运蛋白、受体和其药物作用靶点的基因多态性有关。三磷酸腺苷结合盒转运体 a1(atp binging cassette transporter a1, abca1)基因是调节细胞内胆固醇外流的关键限速基因，abca1基因r219k位点多态性与hdlc相关[2],本试验采用taqman荧光探针技术，测定原发性高脂血症患者abca1 r219k基因多态性，监测不同基因型患者辛伐他汀治疗前后的血脂水平，探讨abca1基因r219k多态性对血脂水平和调脂药物个体差异性的影响。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择以tc、ldlc升高为主的原发性高脂血症患者80例，其中男性46例，女性34例。年龄31～65，平均(55.38±12.46)岁。入选标准：tc>5.72mmol/l和/或ldlc>3.64mmol/l。排除：(1)家族性高脂血症,1型及2型糖尿病，甲状腺功能减退症，肾病综合征，库欣氏综合征及其他继发性高脂血症;(2)研究前4周及研究期间有以下合并用药：其他调脂药物、β受体阻滞剂、噻嗪类利尿剂、糖皮质激素、环孢素a、大环内酯类药物、吡咯类抗真菌类药物、hiv蛋白酶抑制剂、奈法唑酮、二氢吡啶类钙通道阻滞剂以及华法林等;(3)合并有肝、肾功能异常者，严重胃十二指肠疾患，急性及慢性肝脏疾患，肌炎等肌肉病变，冠心病，肿瘤及严重营养不良，酗酒及药物滥用者，体重指数(bmi)>30kg/m2者，嗜好饮柚子汁者，3个月内有手术及严重创伤者，孕妇及哺乳期妇女，对他汀类药物过敏者，精神障碍者。
1.2 方法
根据入选及排除标准初步入选的患者进行4周低脂饮食控制后，禁食12 h，次日晨采空腹静脉血进行复筛，不抗凝血分离血清用于测定血脂、肝功能、肾功能、肌酸磷酸激酶(ck);edta抗凝血分离血浆及血细胞，于-20℃保存用于提取dna。复筛后再次符合入选标准患者给予辛伐他汀每晚20mg口服。于用药第4周清晨空腹采静脉血分离血清，用于测定肝、肾功能，ck，肝、肾功能，ck明显升高者(达到正常高限3倍以上)退出试验。口服药物后第8周，清晨空腹采静脉血，其中不抗凝血分离血清，测定血脂，肝、肾功能及ck，edta抗凝血分离血细胞，于-20 ℃保存用于提取dna。
全部入选患者均签署知情同意书。
1.3 实验资料
1.3.1 材料和仪器：实验药品：辛伐他汀(商品名：舒降之)，规格为每片20mg，批号p1012，为杭州默沙东制药有限公司生产。采用日本日立7600型全自动生化分析仪进行血生化检测，聚合酶链式反应(pcr)试剂由上海复星实业股份有限公司提供, abi prism 7700序列检测仪由上海三科仪器有限公司提供。使用全自动生化分析仪测定血清tc、甘油三酯(tg)、hdlc、ldlc、ck及肝、肾功能; taqman荧光探针技术进行基因的扩增及检测。
1.3.2 探针及引物：运用primer expressv1.7软件，设计合适的引物和探针。探针5′端标记的荧光报告基团是6-羧基萤光素(fam)，3′端标记的荧光淬灭基团是6-羟基四甲基若丹明(tamra)。引物序列为：上游引物: 5′-gtatttttgcaaggctaccagttacatttgacaa-3′;下游引物: 5′-gattggcttcaggatgtccatgttggaa-3′。
1.3.3 实验流程：(1)首先按常规酚-氯仿方法抽提基因组dna;(2)pcr配方:1×taqman universal pcr master mix(通用pcr标准混合试验盒),引物各900nmol/l，探针各250nmol/l，模板10～50ng;(3)pcr程序:55℃2min，95℃10min，95℃15s,61℃45s,反应40个循环;(4)使用abi prism 7700序列检测仪，检测pcr产物荧光强度变化。
1.4 统计学方法
使用spss 10.0统计分析软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差(±s)表示，多组间血脂水平比较使用方差分析，治疗前后血脂比较使用t检验，p<0.05为差异有显著性。
2 结 果
本研究80例患者均完成实验，服用辛伐他汀期间，均未出现肌痛、横纹肌溶解等严重药物不良反应。abca1基因r219k位点基因多态性检测到3种基因型：rr、rk和kk型，分别为32例、38例和10例患者。在辛伐他汀治疗前，三组之间tc、tg、ldlc水平无显著差异，但是rr基因型和rk基因型血清hdlc水平较kk基因型低(p<0.05)。经辛伐他汀治疗8周后，三组tc、tg、ldlc均较前明显降低，hdlc较前升高，各基因组治疗前后血脂水平相比均有显著性差异(p<0.05)，均对辛伐他汀反应良好。辛伐他汀治疗后hdlc水平在rr、rk基因型与kk基因型之间仍有显著性差异，rr、rk基因型的仍低于kk基因型(p<0.05)(表1)。比较三组间血脂变化水平发现，不同基因型组之间tc、tg、ldlc降低幅度及hdlc升高幅度无显著性差异(p>0.05)(表1)。表1 三磷酸腺苷结合匣式转运体a1 r219k三种(rr、rk、kk)基因型血脂水平比较(略)注：与kk基因型之间比较△p<0.05;三种基因型治疗前后对比* p<0.05。
3 讨 论
他汀类药物治疗存在明显的个体差异性，其降低血浆ldlc及升高 hdlc的幅度在个体间差异由10%-70%不等[3]。目前已经有多项研究证实，基因多态性与血脂水平及他汀类药物治疗的个体差异有密切联系。abca1基因所编码的abca1蛋白参与胆固醇的逆转运的初始环节，在胆固醇逆转运和hdl生成的起始步骤中起重要作用。abca1基因位于9q31，约149kb，包括外显子50个，内含子49个，abca1基因的一些常见单核苷酸多态性也影响血脂水平、动脉粥样硬化产生和冠心病的严重程度[4,5]。abca1基因r219k是7号外显子第1051位核苷酸g变成a,使abca1蛋白质第219位的精氨酸(r)变成赖氨酸(k)。rr型中的碱基c突变为kk型中的t,即互补链中的g突变为a,相应氨基酸编码由agg (精氨酸)变为aag (赖氨酸)。clee等[6]报道r219k可产生有益的血脂改变、降低动脉粥样硬化程度,而且变异发生较常见,提出k等位基因对于减少冠心病的发生具有保护作用。其他研究也认为abca1 r219k与预防冠心病发生的保护作用密切相关[7] 。但经过他汀类药物治疗后hdlc上升水平是否受此基因多态的影响尚无试验证据。
本实验测定了高脂血症人群中r219k单核苷酸多态性的发生及对hdlc的影响，并且比较了在辛伐他汀治疗前后hdlc水平的改变，来确定该位点单核苷酸多态性是否与辛伐他汀提高hdlc的个体差异性有关。实验结果发现存在三种基因型，即rr、rk和kk基因型。kk基因型占12.5%，较文献报道[8](14.3%)略偏低，rk基因型47.5%，rr基因型40%，与文献报道相近。分析不同基因型血脂水平显示：三种基因型在辛伐他汀治疗前tc、tg及ldlc 水平没有显著性差异，而hdlc水平为：rr基因型0.05)，而rr基因型和rk基因型较kk基因型hdlc水平均显著降低(p<0.05)。该结果进一步证实了在中国汉族人群中，k等位基因的存在与高hdlc水平相关。经过辛伐他汀20mg/d 8周治疗后，各基因型治疗前后tc、tg、ldlc水平均有降低，hdlc均有升高，有显著性差异，调脂疗效良好。hdlc在rr/rk基因型仍低于kk型,有显著性差异(p<0.05)。三种基因型治疗前后tc、tg、ldlc降低幅度及hdlc升高幅度无显著性差异(p>0.05)。由此结果提示，k等位基因的存在可引起hdlc水平的升高，但与辛伐他汀治疗的个体差异性无关。局限与不足：本实验样本量为80例，对于基因发生频率来讲，样本量是不充足的，但是本实验的基因发生频率与文献报道相近，故而仍有代表性;另外，他汀类药物的个体差异往往是多个综合因素的结果，要明确他汀类药物的个体差异的基因组学原因，需要进行大规模、多个位点的综合研究。
【参考文献】
[1]segbo j, zhou x, fang l, et al. study on single nucleotide polymorphism in the hmgcr gene and its correlation with hypercholesterolemia[j]. inspection medicine & clinics, 2002, 2(1):12-14.
[2] tregouet da, ricard s, niccaud v, et al. analysis of abca1 gene polymorphisms in relation to plasma apoa1 levels and myocardial infarction [j].arteriosclerosis, thrombosis vasc biol, 2004, 24:775.
[3] aguilarsalinas ca, barrett h, schonfeld g, et al. metabolic modes of action of the hyperlipoprotein emias[j]. atherosclerosis, 1998, 141: 203-207.
[4] kyriakou t, pontefractd e, viturro e, et al. functional polymorphism in abca1 influences age of symptom onset in coronary artery disease patients[ j].hum mol genet, 2007, 16(12): 1412-1422.
[5] soropaavonena, naukkarinen j, leerueckertm, et al. common abca1 variants, hdl levels, and cellular cholesterol efflux in subjects with familial low hdl[j].j lipid res,2007, 48(6): 1409-1416.
[6] clee sm, zwinderman ah, engert jc, et al. common genetic variation in abca1 is associated with altered lipoprotein levels and a modified risk for coronary artery disease[j].circulation, 2001, 103(9): 1198-1205.
[7] andrikovicsh, pongrácz e, kalinaá, et al. decreased frequencies of abca1 polymorphisms r219k and v771m in hungarian patients with cerebrovascular and cardiovascular diseases [j].cerebrovasc dis, 2006, 21: 254-259.
[8] 黄健，李红艳,戴玲，等.abca1基因r219k多态性在汉族与壮族人群中的分布[j]. 第四军医大学学报,2007,28(18):1705.
