作者：刘珂，滕继军，王修海 作者单位：青岛大学医学院生物学教研室，山东 青岛 266021； 青岛大学医学院附属医院神经内科）
【摘要】 目的 探讨散发性帕金森病病人parkin基因的突变情况。方法 应用聚合酶链反应单链构象多态性技术(pcrsscp), 对18例帕金森病病人和20例正常人parkin基因的第3、4、5、6、7外显子突变情况进行检测分析。结果 4例病人有parkin基因第3外显子点突变， 1例病人有parkin基因第4外显子点突变，2例病人有parkin基因第5外显子点突变。所有病例均未检测到parkin基因外显子缺失突变。结论 散发性帕金森病病人中存在parkin基因点突变，parkin基因点突变可能是散发性帕金森病发病原因之一。
【关键词】 帕金森病；parkin基因；点突变
帕金森病(pd)是一种由多因素、多个基因相互作用而产生的缓慢进展的神经系统变性疾病。目前人们对其确切的发病机制尚不清楚[1，2]。在对家族性pd相关基因的研究中已经发现10个染色体位点以孟德尔遗传方式与pd基因连锁。目前，已有αsynuclein基因、parkin基因、dj1基因和uchl1基因被克隆[3]。其中，人们对parkin基因的研究最为广泛。1998年，kitada等[4]首次发现并克隆了parkin基因，并发现了此基因外显子的缺失。随后的大量研究结果证实，遗传性parkin基因的突变具有明显的多样性，该基因的12个外显子均有不同程度的序列改变，其中以4、6、7最为常见，它们都处于突变的热点区域。据统计，目前我国pd病人已逾百万，其中许多是散发性pd, 因此，研究散发性pd病人中parkin基因的突变情况具有一定的临床意义。本研究应用聚合酶链反应单链构象多态（pcrsscp）技术，对散发性pd病人parkin基因的5个外显子进行检测分析，以了解散发性pd病人parkin基因的突变情况。
1 资料和方法
1.1 一般资料
pd病人18例，系2007年8月～2008年5月在青岛大学医学院附属医院神经内科pd专科门诊就诊的散发性pd病人，均符合中华医学会2006年制定的pd临床诊断标准[5]，其中男11例，女7例，年龄40～80岁，平均57岁。对照组20例，系同期该院门诊健康查体者，无神经系统遗传病家族史，排除肿瘤及神经系统疾病，其中男10例，女10例，年龄30～50岁。
1.2 检测方法
1.2.1 基因组dna的提取 分别取受检者静脉血2 ml，edta抗凝，使用上海生工生物工程公司基因组dna提取试剂盒提取基因组dna，-20 ℃冰箱冻存。
1.2.2 pcr引物的设计 参照 kitada等[4]方法设计parkin基因第3、4、5、6、7外显子的引物，序列见表1。引物由上海生工生物工程公司合成。
1.2.3 pcr扩增 pcr反应体系含：dna样品3 μl,2 mol/l dntp 2.5 μl,两条20 pmol/l引物各1 μl,10×pcr缓冲液2.5 μl, taqdna聚合酶0.25 μl,加去离子双蒸水至25 μl。扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性50 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，35个循环，再72 ℃延伸7 min。pcr试剂均购自上海生工生物工程公司。
1.2.4 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析 将pcr产物行20 g/l琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，在紫外线灯下观察确定基因是否有缺失突变。对有外显子缺失的标本,以βactin为内对照,与内对照引物共同扩增,证实缺失。
1.2.5 sscp分析 将60 g/l非变性聚丙烯酰胺凝胶在150 v恒压、20 a恒流条件下先行预电泳30 min。取pcr产物7 μl，加7 μl变性液（含有9.8 g/l甲酰胺，10 mol/l naoh，20 mol/l edta，0.50 g/l溴酚兰，0.50 g/l二甲苯氰），98 ℃变性10 min，冰浴10 min后上样，150 v恒压、20 a恒流条件下电泳2 h。取胶，固定、银染、显色后观察结果并拍照。
2 结果
2.1 parkin基因第3～7外显子pcr扩增
18例散发性pd病人及20例正常对照者基因组dna parkin基因第3～7外显子pcr扩增分别获得427、261、227、268和239 bp大小的特异性扩增产物，未见parkin基因外显子的缺失改变。
2.2 parkin基因第3～7外显子pcrsscp检测
4例病人第3外显子有单链泳动变位（图1），1例病人第4外显子有单链泳动变位（图2），2例病人第5外显子有单链泳动变位（图3）。
3 讨论
pd按遗传方式可分为家族性与散发性两种，家族性pd约占pd总数的10%～15%，具有明显家族遗传倾向；而散发性pd则占pd的绝大多数，无明显遗传倾向，但表现为某种遗传易感性。早期发现的parkin基因主要存在于少年型遗传性pd病人中，但最新研究表明，parkin基因外显子的突变并非少年型pd所特有，无论是家族性还是散发性pd、无论年轻时发病还是年老时发病的病人中均存在不同程度及类型的parkin基因突变[6]。这既说明parkin基因在pd的遗传学机制中起着十分重要的作用，同时又说明pd发病机制具有复杂性。parkin基因长500 kp，包括12个外显子。国外研究显示，外显子3和外显子4 缺失最多见，点突变多发生在外显子2、7、9。国内的学者也发现了外显子1～8 的突变；其中，外显子缺失者多见于外显子4和7，点突变多见于外显子2 和7。lucking等[7]对来自5个国家的12个常染色体隐性遗传的青少年型帕金森综合征（arjp） 家族进行筛查，研究parkin基因外显子的缺失与表型的关系，认为不同的家系可能有不同的外显子缺失，从而产生不同的表型特征，这与外显子的功能分工有关[8]。其后，许多学者相继在arjp家族病人的parkin基因外显子中发现了诸多点突变，并提出在pd发病机制中点突变比缺失突变的意义更大。王涛等[9]经测序证实1例早发性pd病人的外显子7中存在一个未曾报道过的新的点突变位点gly284arg，并认为parkin基因点突变也是我国早发性pd病人的致病原因之一。徐严明等[10]研究推测，parkin基因外显子1、2突变可能与部分散发性早发pd发病有关。本研究在18例标本中没有发现parkin基因相关外显子缺失，可能与pd病人标本的类型有关。目前有研究显示，parkin基因的突变类型与pd的遗传类型具有一定的相关性，家族性pd主要表现为大片段外显子的缺失突变，而散发性pd主要以parkin基因的点突变为主。本研究应用pcrsscp技术对18例散发性pd病人标本进行检测，结果显示，parkin基因外显子3、4、5均有突变发生。这与王涛等[9]研究结果类似，也与pd的临床发病规律相吻合。可见点突变比缺失突变更多见，parkin基因外显子突变可能与部分散发性pd发病有关。
表1 parkin 基因第3～7 外显子引物序列引物名称（略）
图1 parkin基因第3外显子sscp检测（略）
m1、m2为标准分子质量marker，①、②为pd病人，③～⑥为正常对照者
图2 parkin基因第4外显子sscp检测（略）
m1、m2为标准分子质量marker，③为pd病人，①、②、④为正常对照者
图3 parkin基因第5外显子sscp检测（略）
m1、m2为标准分子质量marker，①为pd病人，②～④为正常对照者
目前，国内外研究人员发现的各相关基因都只能解释部分家族性pd的发病原因，且即使是同一基因在不同人群中突变的性质和部位也有所不同，这表明不同人种和地域的pd 病人可能存在不同的致病基因，或有一普通存在的致病基因而目前尚未被发现。筛查不同人群的pd 相关基因，寻找更为普通存在的致病基因的工作还有待深入进行。
【参考文献】
[1]陈彪,刘焯霖,王枫,等. 中国帕金森病遗传研究进展[j]. 中华神经科杂志, 2005, 38(3):160163.
[2]谢安木,薛莉,刘焯霖. synphilin1寡核苷酸对帕金森病酪氨酸羟化酶表达的影响[j]. 青岛大学医学院学报, 2007,43(3):199.
[3]toda t, momose y, murata m, et al. toward identification of susceptibility genes for sporadic parkinson’s disease[j]. j neurol, 2003,250(suppl 3):4043.
[4]kitada t, asakawa s, hattori n, et al. mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism[j]. nature, 1998,392:605.
[5]中华医学会神经病学分会运动障碍及帕金森病学组. 帕金森病的诊断[j]. 中华神经科杂志, 2006,39(6):408409.
[6]李立宏,高国栋. 帕金森病基因突变多态性与其家族性和散发性的关系[j]. 中国临床康复, 2005,9(17):1315.
[7]lucking c b, durr a, bonifati v, et al. association between early onset parkinson’s disease and mutation in the parkin gene[j]. new engl j med, 2000,342:15601567.
[8]hedrich k, eskelson c, wilmot b, et al. distribution, type, and origin of parkin mutations: review and case studies[j]. mov disord, 2004,19:11461157.
[9]王涛,梁直厚,孙圣刚,等. 帕金森病患者parkin基因点突变[j]. 中国临床康复, 2003,7(13):1892.
[10]徐严明,刘焯霖,陈彪,等. 散发性早发帕金森病parkin基因1、2号外显子突变的研究[j]. 中山医科大学学报, 2001,22(3):209221.
