【摘要】 为了探讨间充质干细胞(mesenchymal stem cell, msc)诱导而来的内皮细胞的免疫调控能力，将人骨髓msc在体外经vegf诱导分化为内皮细胞，并用倒置相差显微镜和流式细胞术分别观察和检测细胞的形态和免疫表型，用淋巴细胞转化实验观察其免疫调控能力。结果表明： msc在向内皮细胞分化的体系中生长迅速，诱导后的细胞经von willebrand factor (vwf)免疫荧光染色呈阳性，能在matrigel上形成毛细血管样网状结构。细胞表面标记无明显改变，即cd73、cd105、hlaabc仍阳性，cd34、 cd80、 cd86、 hladr、 cd31仍为阴性。由msc诱导分化而来的内皮细胞能抑制t淋巴细胞的增殖，其抑制作用随内皮细胞加入量的增多而增强。结论：由骨髓msc来源的内皮细胞对t淋巴细胞具有调控作用。
【关键词】 间充质干细胞 免疫调控
endothelial cells derived from mesenchymal stem cells harbor immunoregulatory effects
jiang xiaoxia*, chen jinsong*1, su yongfeng, liao can1, liu bing, mao ning
institute of basic medical sciences, academy of military medical sciences, beijing 100850, china; 1guangzhou cord blood bank, guangzhou maternal neenatal hospital, guangzhou 510180, china
abstract this study was purposed to investigate the immunoregulatory effect of endothelial cells derived from mesenchymal stem cells (msc). the human msc was induced to differentiate into endothelial cells for one week. the phenotypes were evaluated by flow cytometry, the cell morphologic feature was observed by invert phasecontrast microsoope and analysis of capillary formation was performed by using the in vitro angiogenesis kit. the immunoregulatory effect was detected by lymphocyte transformation test. the result indicated that during the differentiation cells grew fast and there was no significant change in the phenotypes, i.e. cd73，cd105，hlaabc were positive and cd34, cd80, cd86, hladr, cd31 were negative. immunofluorescence analysis showed typical expression of the von willebrand factor. differentiated mscs formed capillarylike structure. endothelial cells derived from msc also revealed immunosuppressive effect on t cell proliferation in a dosedependent manner. it is concluded that endothelial cells derived from msc also harbor immunoregulatory effect on t lymphocytes.
key words mesenchymal stem cell; endothelial cell; immunoregulatory effect
j exp hematol 2007; 15(1):175-178
间充质干细胞(msc)起源于中胚层，免疫原性低, 移植后无免疫排斥反应，对多种免疫细胞具有调控功能［1］，且在体外可大量增殖培养。若将msc定向诱导，分化为血管内皮细胞，在体外构建成理想的血管移植物，在血管组织工程和再生医学领域必将有广阔的应用前景。
为了研究成体msc向血管内皮细胞分化的能力，摸索msc体外诱导分化为内皮细胞的实验条件，以及探讨msc分化为内皮细胞后应用于血管损伤修复方面的可行性，我们分离纯化骨髓msc后，选取合适的条件，将msc诱导分化为内皮细胞，并观察其对t淋巴细胞的免疫调控能力。
材料和方法
msc分离培养及鉴定
msc分离培养 取正常人骨髓以肝素抗凝，用pbs稀释后，密度梯度离心(percoll 比重 1.077 g/ml)分离单个核细胞，按2×105/cm2加入含10%胎牛血清(hyclone公司产品) 的dmemlg培养液的75 cm2培养瓶中，于37℃、5% co2、饱和湿度的培养箱中培养48小时后去除非贴壁细胞，并更换新鲜培养体系，继续培养，待细胞90%融合时，用0.05%胰酶消化，按5 000 cells/cm2的密度传代培养，取第3代至第7代的细胞进行实验。
间充质干细胞分化而来的内皮细胞具有免疫调控能力msc表面标志测定 用0.05%胰酶消化收获细胞，用流式细胞术按常规测定以下指标：cd34、cd45、cd31、cd80、cd86、cd73、cd105、hlaabc、hladr(pharmingen 公司产品)。间接免疫荧光染色法测定vwf(一抗是鼠抗人vwf抗体，novocastra laboratories 公司产品；二抗是fitc标记的羊抗鼠igg，southern biotech公司产品)。vwf标记前细胞首先用4%多聚甲醛固定10分钟，再用0.5%triton100透膜处理10分钟，然后与一抗(1∶100)孵育60分钟，离心洗涤后二抗孵育30分钟，再次洗涤后在荧光显微镜下观察细胞，并设立阴性对照样品(细胞只加二抗孵育)。
msc多向分化潜能鉴定 msc以0.5×104/well接种于24孔板，用含10% fbs的dmemhg培养液，加入地塞米松0.1 μmol/l、β磷酸甘油10 mmol/l、抗坏血酸磷酸盐50 μmol/l，以诱导分化成成骨细胞，每3天半量换液体，7天后碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞形成； 与此同时，msc以1.7×104/well接种于24孔板,加入地塞米松1 μmol/l、胰岛素10 μg/ml、ibmx 0.5 mmol/l、消炎痛200 μmol/l，以诱导分化成脂肪细胞，油红染色鉴定脂滴形成。
msc向内皮细胞诱导分化及鉴定
诱导培养 诱导培养体系是含5% fbs的dmemhg加细胞因子vegf(20 ng/ml， r&d公司vegf121), msc接种于75 cm2的培养瓶，其密度为3 000 cells/cm2，于37℃、5% co2、饱和湿度的培养箱中培养7天，每2天半量换液，收获的细胞一部分用于检测鉴定，另一部分加入淋巴细胞转化实验的反应体系中，观察其对淋巴细胞的免疫调控作用。
流式细胞术检测 对向内皮细胞诱导7天后细胞的免疫表型： cd34、cd45、cd31、cd80、cd86、cd73、cd105、hlaabc、hladr，用间接免疫荧光技术标记vwf，方法同前。
体外血管生成实验 用体外血管生成模型试剂盒(chemicon公司产品)，观察在半固体matrigel上诱导后的细胞形成毛细血管样网状结构的能力。将matrigel置于4 ℃冰水浴中融化，按30 μl/well铺于96孔板，在37℃培养箱放置1小时后，加入诱导分化内皮细胞7天的细胞，5×103/well，2小时后开始在倒置显微镜下观察细胞形成管状结构的形态。
诱导后细胞的免疫调控能力
细胞接种 诱导后的msc细胞分别按0.2×104/well、0.4×104/well、2×104/well接种于96孔板，即内皮细胞与t淋巴细胞（2×105/well）比例分别为1∶100， 1∶50和1∶10。每组细胞设5个复孔。待细胞贴壁后再加入t淋巴细胞。
淋巴细胞转化 淋巴细胞采自健康成人的外周血，用ficoll(比重1.077 g/ml)离心分离单个核细胞，用磁珠(miltenyi公司产品)分离纯化cd3+t细胞。t淋巴细胞重悬于含20% fbs的rpmi 1640 培养液，以2×105/well加入已经铺有贴壁细胞的96孔板，并加入终浓度为10 μg/ml植物血凝素(pha)，刺激t淋巴细胞增殖。以单纯t细胞加pha作为对照组。细胞于37℃、5% co2、饱和湿度孵育84小时后,加3h标记的脱氧胸腺嘧啶苷(3htdr， 中国科学院原子能研究所提供)1 μci/well，标记12小时后，收集细胞，用液体闪烁计数仪(wallac公司产品)检测cpm值，观察msc诱导对淋巴细胞转化的作用。
结 果
msc诱导分化为内皮细胞
本实验所采用的骨髓msc经过鉴定，具有分化为成骨细胞和脂肪细胞的能力。流式细胞术检测msc表面抗原： cd34、cd45、cd31、cd80、cd86、hladr、vwf为阴性，cd73、cd105、hlaabc为阳性，3代以后的细胞纯度超过95%，将第3到第7代间的msc用于内皮细胞诱导。
向内皮细胞诱导分化7天的msc在显微镜下呈现形态无明显改变。在诱导体系中，msc的生长速度比普通培养条件下稍快，3天可形成致密的贴壁细胞层。
免疫荧光标记诱导7天后的细胞显示，vwf为阳性(图 1)，对照组msc细胞为阴性。细胞其它表面标记无明显改变，即cd73、cd105、hlaabc仍为阳性；cd34、cd45、cd80、cd86、hladr、cd31仍为阴性。
向内皮诱导7天后的msc具有在半固体matrigel胶上形成毛细血管样网状结构能力。相差显微镜下观察发现，用胰酶消化下来的细胞接种在matrigel上，2小时后开始伸出丝状触突(图 2)，4小时后相邻的细胞通过触突互相连通，并逐渐通过管状结构联成网状。随后细胞缓慢聚集，形成粗管状结构。而对照组未诱导的msc不能形成这种管状结构。
msc诱导分化的内皮细胞对淋巴细胞转化的影响
经过pha刺激后t淋巴细胞增殖迅速， cpm值为(16.13±1.83)×103(图 3)，表明加入msc诱导分化的内皮细胞对t淋巴细胞的增殖有抑制作用。当加入细胞量分别为200、400、2 000，即与t淋巴细胞的比例从 1∶100增加到1∶50 和1∶10，其抑制效应逐渐增强， cpm值分别是(14.22±1.67)×103、(12.36±1.08)×103和(0.83±0.09)×103（图3）。由此可见，msc向内皮细胞诱导分化以后，仍然具有免疫调控能力，其抑制效应与加入的内皮细胞浓度有关。
讨 论
研究表明，出生后人体内一直存在有内皮干细胞，参与新生血管形成。有研究人员从骨髓、外周血、脐血等组织分离出内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, epcs)［2-4］，其特征为cd133+、cd34+、kdr+或cd14+。也有研究人员从骨髓msc诱导分化出内皮细胞［5］，msc在小鼠体内也被发现能分化为内皮细胞［6］，甚至有报道指出，msc与肿瘤血管形成有关［7］。msc本身具有部分内皮细胞的表型：表达cd105(内皮糖蛋白endoglin)，endoglin主要分布在内皮细胞，与血管的发育有关； 表达黏附分子vcam1、icam1、integrin β3以及内皮细胞特异性的血管内皮生长因子受体vegfr2(kdr/flk1)等。
无论是用cd34+细胞，还是用cd34-的msc体外诱导的内皮细胞，vegf都是主要的诱导因子 ［ 8,9 ］。本实验采用人骨髓msc，在含vegf(20 ng/ml)的分化诱导体系中培养7天，获得了内皮样细胞，特异性表达抗原vwf，在半固体matrigel上能形成毛细血管样管状结构。但是，直至将细胞诱导培养14天仍然未检测到cd31表达，诱导的细胞不能吞噬dilacldl，其原因可能与内皮细胞分化阶段有关。
引人注意的是，msc诱导分化成为内皮样细胞后，仍然具有免疫调控功能，正如msc分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞后仍保持原来的免疫调节功能［10］。从实验结果来看，其抑制作用依赖于细胞的剂量，当其与t淋巴细胞比例为1∶10的时候，抑制率可达56%。由msc诱导来的内皮细胞的这种特性使其在血管组织修复的应用中呈现良好的前景，低免疫原性及免疫抑制功能有利于血管移植物的植入和生长，能维持血管腔长期通畅。同时作为干细胞来源的msc又具有取材方便、适合体外大量培养扩增的优点，能很好地解决临床应用中如何大量获取干细胞来源问题，因而可以广泛地应用于心血管疾病的治疗及组织器官移植。
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