转化生长因子β1/整合素连接激酶信号通路在大鼠肾小管上皮细胞转分化中的作用及大黄素对其的干预效应

【摘要】 目的：研究转化生长因子β1/整合素连接激酶（transforming growth factorbeta1/integrinlinked kinase, tgfβ1/ilk）信号通路在白细胞介素1β（interleukin1β, il1β）诱导的大鼠肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化（tubular epithelialmyofibroblast transdifferentiation, temt）中的作用，并探讨大黄素是否是通过抑制tgfβ1/ilk信号通路而影响temt。方法：以体外培养的正常大鼠肾小管上皮细胞株（nrk52e）为研究对象，分为空白对照组、大黄素对照组、il1β诱导组、大黄素阻断组、tgfβ1ⅰ型受体阻断剂（sb431542）阻断组、大黄素和sb431542共同阻断组、大黄素预处理组和大黄素逆转组。nrk52e细胞在上述处理因素下培养48 h后，在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化；免疫组化双标法检测细胞表型标志物α平滑肌肌动蛋白（alphasmooth muscle actin, αsma）和e钙黏连素（ecadherin）的表达；免疫组化单染法检测nrk52e细胞tgfβ1和ilk的表达，采用图像分析软件定量分析免疫组化染色结果；酶联免疫吸附测定法测定nrk52e细胞分泌的纤维连接蛋白（fibronectin, fn）含量。结果：与空白对照组比较，il1β诱导temt的同时tgfβ1和ilk表达增加（p<0.05），大黄素可明显抑制il1β诱导的上述变化（p<0.05）。阻断tgfβ1信号通路后，il1β诱导的temt明显受抑，且ilk表达减少。与大黄素阻断剂组比较，大黄素预处理不能预防il1β诱导的temt，大黄素不能逆转il1β诱导的temt。相关分析显示，tgfβ1表达与αsma、fn、ilk表达呈正相关，与e钙黏连素表达呈负相关。ilk表达与αsma、fn表达呈正相关，与e钙黏连素表达呈负相关。结论：il1β通过激活tgfβ1/ilk信号通路蛋白而诱导temt，大黄素通过抑制tgfβ1/ilk信号通路蛋白而抑制il1β诱导temt。

【关键词】 白细胞介素1β; 大黄素; 转化生长因子β1; 整合素连接激酶; 大鼠

chen tf, chen m, qin jh, wang my. j chin integr med. 2009; 7(1): 5964.

received july 10, 2008; accepted september 29, 2008; published online january 15, 2009.

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doi: 10.3736/jcim20090109open access

interventional effects of emodin on transforming growth factorbeta1/integrinlinked kinase signal way in interleukin1βinduced transdifferentiation of rat tubular epithelialmyofibroblasts

tingfang chen1, ming chen1, jianhua qin1, mingyong wang2

1. department of nephrology, affiliated hospital, luzhou medical college, luzhou, sichuan province 646000, china

2. laboratory of infection and immunity, affiliated hospital, luzhou medical college, luzhou, sichuan province 646000, china

objective: to study the effects of transforming growth factorbeta1/integrinlinked kinase (tgfβ1/ilk) signal way in interleukin1β (il1β)induced rat tubular epithelialmyofibroblast transdifferentiation (temt), and to investigate whether emodin inhibits il1βinduced temt through the tgfβ1/ilk signal waydependent mechanism.

methods: normal rat kidney epithelial cell line (nrk52e) was used in this study. nrk52e cells were divided into blank control group, emodin control group, il1βinduced group, emodininhibited group, sb431542 (tgfβ1 type ⅰ receptor blocker)inhibited group, emodin plus sb431542inhibited group, emodinpretreated group and emodinreversed group. after 48hour culture, morphological changes of the nrk52e cells were observed by an inverted phase contrast microscope. the expressions of alphasmooth muscle actin (αsma) and ecadherin were detected by twocolor immunohistochemical staining, while the expressions of tgfβ1 and ilk were detected by onecolor immunohistochemical staining. we also performed the imaging analysis to quantitatively analyze the result of the immunohistochemical staining. the secretion of fibronectin (fn) was analyzed by enzymelinked immunosorbent assay.

results: compared with the blank control group, il1β might induce temt, which was showed in increasing expression of αsma, increasing secreting of fn and decreasing expression of ecadherin, and at the same time the expressions of tgfβ1 and ilk were enhanced (p<0.05). emodin might inhibit all of those changes induced by il1β (p<0.05). when tgfβ1 signal way was intercepted, il1β inducedtemt was suppressed and the expression of ilk was decreased, however, there was no significant difference in expression of tgfβ1 between the sb431542 group and the il1βinduced group. compared with emodininhibited group, emodinpretreatment could not prevent il1β inducedtemt in a certain extent, but emodin could not revert il1βinduced temt. spearman correlation analysis showed that tgfβ1 expression had positive correlation with expressions of αsma, fn, ilk and negative correlation with ecadherin expression, and the expression of ilk was positively correlated with the expressions of αsma and fn and negatively correlated with ecadherin expression.

conclusion: il1β induces temt partly depending on tgfβ1/ilk signal way, partly via which emodin inhibits the temt induced by il1β.

keywords: interleukin1β; emodin; transforming growth factorbeta1; integrinlinked kinase; rats

肾间质纤维化是多种肾脏疾病进展至终末期的共同病理表现，研究认为肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化（tubular epithelialmyofibroblast transdifferentiation, temt）而成的肌成纤维细胞是生成细胞外基质的主要细胞［1］。关于肾小管上皮细胞转分化的分子机制尚未完全阐明，最近研究表明转化生长因子β1/整合素连接激酶（transforming growth factorbeta1/integrinlinked kinase, tgfβ1/ilk）参与肾间质纤维化的发生［2］。大黄素可通过影响细胞表型转化，抑制促纤维化因子的合成与分泌，调节细胞外基质合成与降解等机制抗肾间质纤维化［3］。本实验旨在阐明tgfβ1/ilk信号通路是否参与了temt，及大黄素是否通过影响tgfβ1/ilk信号通路抑制temt，进而达到抗肾间质纤维化作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂正常大鼠肾小管上皮细胞株（nrk52e）来源于美国菌种细胞保藏数据库(american type culture collection, atcc)，由四川大学华西医院肾内科惠赠；大黄素，南京清泽医药科技开发有限公司提供；白细胞介素1β（interleukin1β, il1β），以色列cytolab公司提供；小鼠抗大鼠α平滑肌肌动蛋白（alphasmooth muscle actin, αsma）单克隆抗体，boster生物公司提供；兔抗大鼠ilk多克隆抗体、兔抗大鼠e钙黏连素（ecadherin）多克隆抗体、兔抗大鼠tgfβ1多克隆抗体、tgfβ1ⅰ型受体阻断剂sb431542，santa cruz公司提供；大鼠纤维连接蛋白（fibronectin, fn）酶联免疫吸附测定（enzymelinked immunosorbent assay, elisa）试剂盒和双染histostaintmds试剂盒，北京中杉金桥生物技术公司提供。

1.2 实验分组和干预处理 nrk52e细胞常规培养于37 ℃、5% co2饱和湿度孵箱中，培养液均为含5%小牛血清的dmem（sigma公司）。细胞培养至80％融合后传代，传3～5代后以1.0×107个/l接种于装有无菌玻片的6孔板，每孔2 ml，培养12 h，换用无血清的dmem培养液继续培养24 h，使其处于g0期。将nrk52e细胞分为8组。（1）空白对照组：仅加入培养液；（2）大黄素对照组：加入含大黄素的培养液，大黄素终浓度为25 mg/l（以下大黄素终浓度均为此浓度）；（3）il1β诱导组：加入含il1β的培养液，il1β终浓度为0.01 mg/l（以下il1β的终浓度均为此浓度）；（4）大黄素阻断组：加入含il1β和大黄素的培养液；（5）sb431542阻断组：加含sb431542的培养液，用终浓度为10 mmol/l sb431542的培养液（以下sb431542的终浓度均为此浓度）预孵1 h后，换为含sb431542和il1β的培养液；（6）大黄素和sb431542共同阻断组：加含sb431542的培养液预孵1 h后换为含sb431542、il1β和大黄素的培养液；（7）大黄素预处理组：加入含大黄素的培养液预孵24 h后再换为含il1β和大黄素的培养液；（8）大黄素逆转组：加入含il1β的培养液预孵24 h后再加入含大黄素的培养液。每组设6个复孔。

1.3 nrk52e细胞形态学观察上述各组细胞培养48 h后，在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。

1.4 免疫组化检测nrk52e细胞ilk、tgfβ1、αsma和e钙黏连素表达各组细胞培养48 h后，取出预留的盖玻片，用4％多聚甲醛固定。免疫组化双染标记法检测αsma和e钙黏连素的表达，按双染试剂盒说明书步骤操作。αsma用5溴4氯3吲哚磷酸/硝基苯硫氰酸（bcip/nbt）染色，e钙黏连素用3氨基9乙基卡巴唑（aec）显色。应用常规的二步法检测ilk（aec显色）和tgfβ1的表达［3,3二氨基联苯胺（dab）显色］。

1.5 elisa法检测nrk52e细胞fn分泌取上述各组细胞培养上清液，在包被反应板每孔加入标准品或待测标本100 μl，空白对照孔中加入稀释液100 μl，37 ℃孵育2 h。弃去液体，加生物素抗fn抗体，孵育1 h。洗涤后加亲和素过氧化物酶复合物抗体工作液，孵育30 min，加显色液和终止液。在酶标仪上450 nm处测定光密度（optical density，od）值。根据od值在试剂盒提供的标准曲线上找出对应浓度。

1.6 定量分析nrk52e细胞免疫组化染色结果采用imagepro p1us (ipp) version 4.5专业图像分析软件(美国media cybernetics)进行分析。每张盖玻片在高倍镜（×400）下随机选取上、中、下、左、右5个视野，摄像并存入计算机，然后用ipp进行分析（在“intensity cal”中定义背景色，在“count/size”中将阳性目标从背景色中分离出来，用阳性细胞的积分od值代表各种蛋白表达量的多少）［4］。

1.7 统计学方法计量资料用x±s表示，各实验组和对照组间的比较采用spss 10.0统计软件包进行单因素方差分析，各组间两两比较采用lsdt检验。各项指标之间作spearman秩相关分析。

2 结果

2.1 il1β、大黄素和sb431542对nrk52e细胞形态学的影响空白对照组和大黄素对照组nrk52e细胞具有典型的立方形或球形的上皮细胞铺路石样形态学特征（图1a和图1b）。il1β诱导组nrk52e细胞发生明显的形态学改变，显示成纤维细胞样外观，转分化的细胞明显肥大、拉长，丧失其铺路石样生长方式（图1c）。大黄素阻断组、sb431542阻断组、大黄素和sb431542共同阻断组以及大黄素预处理组的细胞与对照组细胞形态差别不大（图1d、e、f和g）。与il1β诱导组比较，大黄素逆转组细胞无明显形态改变（图1h）。

2.2 il1β、大黄素和sb431542对nrk52e细胞表型标志物αsma和e钙黏连素的影响空白对照组和大黄素对照组nrk52e细胞胞浆和胞膜e钙黏连素（红色）表达呈阳性，未见αsma（暗紫色）表达，两组间比较，差异无统计学意义（p＞0.05）。和空白对照组比较，il1β诱导组和大黄素逆转组在胞浆αsma表达呈阳性（p<0.05），而e钙黏连素仅在胞膜微弱表达（p<0.05），两组间比较差异无统计学意义（p＞0.05）。与il1β诱导组比较，大黄素阻断组、sb431542阻断组、大黄素和sb431542共同阻断组以及大黄素预处理组胞浆αsma表达减弱（p<0.05），在胞浆和胞膜e钙黏连素表达增强（p<0.05）。αsma表达由强到弱，e钙黏连素表达由弱到强的顺序为大黄素阻断组、sb431542阻断组、大黄素和sb431542共同阻断组。大黄素预处理组和大黄素阻断组比较，αsma、e钙黏连素的表达差异无统计学意义（p＞0.05）。见表1。

2.3 il1β、大黄素和sb431542对nrk52e细胞表达tgfβ1的影响 tgfβ1通过dab染色染成棕黄色。空白对照组和大黄素对照组nrk52e细胞胞浆tgfβ1微弱表达，两组间比较差异无统计学意义（p＞0.05）。与空白对照组比较，il1β诱导组、sb431542阻断组和大黄素逆转组胞浆tgfβ1表达增强（p<0.05），3组间比较差异无统计学意义（p＞0.05）。与il1β诱导组比较，大黄素阻断组、大黄素和sb431542共同阻断组以及大黄素预处理组tgfβ1在胞浆表达减弱（p<0.05），3组间比较差异无统计学意义（p＞0.05）。见表1。

2.4 il1β、大黄素和sb431542对nrk52e细胞表达ilk的影响 ilk通过aec染色染成猩红色。空白对照组和大黄素对照组nrk52e细胞在胞浆和胞膜微弱表达ilk，两组间比较差异无统计学意义（p＞0.05）。与空白对照组比较，il1β诱导组和大黄素逆转组ilk在胞浆和胞膜表达增强（p<0.05），而两组组间比较差异无统计学意义（p＞0.05）。与il1β诱导组比较，大黄素阻断组、sb431542阻断组、大黄素和sb431542共同阻断组以及大黄素预处理组胞浆和胞膜ilk表达减弱（p<0.05）。ilk表达由强到弱的顺序为大黄素阻断组、sb431542阻断组、大黄素和sb431542共同阻断组。大黄素预处理组和大黄素阻断组ilk的表达比较，差异无统计学意义（p＞0.05）。见表1。

2.5 il1β、大黄素和sb431542对nrk52e细胞分泌fn的影响空白对照组和大黄素对照组以及大黄素预处理组nrk52e细胞分泌fn量比较差异无统计学意义（p＞0.05）。il1β诱导组和大黄素逆转组fn分泌较空白对照组增加（p<0.05），而两组组间比较差异无统计学意义（p＞0.05）。大黄素阻断组、sb431542阻断组、大黄素和sb431542共同阻断组较il1β诱导组减低（p<0.05）。fn分泌由高到低的顺序为大黄素阻断组、sb431542阻断组、大黄素和sb431542共同阻断组。见表1。

2.6 tgfβ1、ilk的表达和αsma、e钙黏连素表达及fn分泌的相关性分析 spearman秩相关分析结果显示，tgfβ1表达与αsma、fn、ilk表达呈正相关，与e钙黏连素表达呈负相关。ilk表达与αsma、fn表达呈正相关，与e钙黏连素表达呈负相关。见表2。表1 大黄素、sb431542和il1β对nrk52e细胞fn分泌及αsma、ecadherin、tgfβ1和ilk表达的影响表2 tgfβ1、ilk的表达和αsma、e钙黏连素表达及fn分泌的相关性分析

3 讨论

temt指肾小管上皮细胞失去上皮细胞的特性而获得肌成纤维细胞的特性。tgfβ为研究较多，作用较明确的参与转分化的细胞因子之一［5］。我们的实验也表明tgfβ1参与了il1β诱导的temt［6］。由于tgfβ除了促纤维化效应外，还有抗增生和抗炎症的效应，长期完全阻断tgfβ系统必然产生严重不良后果，例如敲除tgfβ1基因的小鼠因完全阻断tgfβ1的活性而产生致死性炎症［7］。因此，调控tgfβ的下游信号介质，可望成为治疗肾脏纤维化的新靶点。

ilk是一种ser/thr蛋白激酶。ilk能够通过与整合素β1亚单位的结合介导细胞与胞外基质的连接，以依赖于磷脂酰肌醇3激酶的方式激活，并通过磷酸化下游底物蛋白激酶b/akt、糖原合酶激酶3等使胞外信号得以向下游传递，参与多种信号传导通路［8］。在肾间质纤维化过程中，ilk是诱导转分化的关键调节因子，可能参与temt的4个关键步骤［9］。li等［2］研究表明，ilk在temt中起关键性的作用，ilk是tgfβ1致temt所必需的。我们的实验结果表明，在il1β诱导细胞发生转分化时tgfβ1、ilk的表达明显增高，且与αsma的表达及fn分泌呈正相关，与e钙黏连素的表达呈负相关，tgfβ1与ilk的表达呈正相关。使用tgfβ1 ⅰ型受体阻断剂（sb431542）阻断tgfβ1/smads信号通路后，细胞转分化受到明显抑制，ilk表达减少。这提示，il1β诱导的nrk52e细胞发生转分化是依赖于tgfβ1和ilk的上调而实现的，ilk是tgfβ1的下游信号间质，tgfβ1/smad/ilk信号通路是调节temt的重要通路。

大黄素为大黄的有效成分之一，化学名为1,3,8三羟基6甲基蒽醌（1,3,8trihydroxy6methylanthraquinone），具有抑菌消炎、抗氧化、抗肿瘤、调节胃肠活动及抗肝、肾纤维化等药理作用［10］。肾小管间质纤维化的过程包括肾小管上皮细胞的丧失和细胞外基质的聚集。大黄素可通过影响细胞表型转化，抑制促纤维化因子的合成与分泌，调节细胞外基质合成与降解等机制抗肾间质纤维化［11, 12］。我们的实验结果提示，大黄素可抑制il1β诱导的nrk52e细胞转分化，但如果il1β已作用一段时间，现有剂量的大黄素（25 mg/l）则无法逆转il1β诱导的temt，也提示大黄素可能阻止或延缓，但不能逆转肾小管间质纤维化。和il1β诱导的同时加入大黄素比较，先加入大黄素预处理未能更有效地抑制temt，说明细胞转分化机制未启动前，大黄素的预处理不会使正常肾小管上皮细胞产生特异的抗temt因子来等待temt的发生。这也提示大黄素没有预防肾小管间质纤维化的作用。在大黄素抑制il1β诱导的temt同时出现tgfβ1和ilk的表达明显减少，提示大黄素通过抑制tgfβ1/ilk信号通路而抑制il1β诱导的temt。大黄素和sb431542共同作用较两者单独作用时抑制ilk表达及temt的作用更明显，这表明大黄素除了通过抑制tgfβ1表达进而抑制ilk表达以外，还可能直接抑制ilk表达或通过抑制其激活依赖酶pi3k等间接途径抑制ilk表达，从而抑制肾小管上皮细胞转分化。目前国内外尚无相关报道。

由此可见tgfβ1/ilk信号通路在细胞转分化中有重要作用，对其的抑制可望阻断temt过程进而抑制肾小管间质纤维化的发生。大黄素可以抑制tgfβ1/ilk信号通路进而抑制转分化的发生，有望成为治疗肾小管间质纤维化的新药。

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