【摘要】 目的：研究益气化瘀补肾方治疗气虚血瘀肾虚型颈椎病大鼠的作用机制。 方法：选择3月龄雌性spf级sd大鼠30只，随机分为正常组、模型组和益气化瘀补肾方组，每组10只。气虚血瘀肾虚型颈椎病模型通过病、证模型复合而成。益气化瘀补肾方组采用益气化瘀补肾方治疗1个月。通过放射免疫学、组织病理学、免疫组织化学和分子生物学等技术研究益气化瘀补肾方的作用机制。结果：与正常组比较，模型组动物出现精神萎靡、少动，舌质、尾色瘀紫，体质量减轻，子宫及附件质量降低，环磷酸腺苷与环磷酸鸟苷及其比值无明显差异，血黏度、血小板表面α颗粒膜糖蛋白（alphagranular membrane protein, cd62p）增高，血清雌二醇（estradiol, e2）降低。益气化瘀补肾方组与模型组比较，除子宫及附件质量外，上述指标均有不同程度改善。he染色显示模型组颈椎间盘高度降低，纤维环出现裂隙，胶原纤维排列紊乱，髓核减少，软骨终板变薄；益气化瘀补肾方组椎间盘高度正常，纤维环排列稍紊乱，髓核结构良好，软骨终板变化不明显。与正常组比较，模型组ⅱ型胶原表达减少；益气化瘀补肾方组ⅱ型胶原在纤维环的表达比模型组有所增加。模型组与正常组比较ⅱ型前胶原基因和基质金属蛋白酶抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinase1, timp1))基因表达降低（p<0.01），益气化瘀补肾方组与模型组比较，ⅱ型前胶原基因和timp1基因表达增高，基质金属蛋白酶13基因表达降低（p<0.05, p<0.01）。 结论：益气化瘀补肾方通过调节免疫、凝血和内分泌系统等改善模型动物气虚血瘀肾虚状态，通过调节椎间盘细胞外基质以及相关金属蛋白酶延缓椎间盘退变。
【关键词】 益气化瘀补肾方; 气虚; 血瘀; 肾虚; 颈椎病; 大鼠
wang yj, shi q, jiang jc, bian q, liang qq, li cg, zhou q, cui xj, lu s, zhou cj. j chin integr med. 2009; 7(1): 5358.
received may 30, 2008; accepted july 24, 2008; published online january 15, 2009.
indexed/abstracted in and full text linkout at pubmed. journal title in pubmed: zhong xi yi jie he xue bao.
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doi: 10.3736/jcim20090108open access
mechanism of yiqi huayu bushen recipe in treating cervical syndrome in rats with qi deficiency, blood stasis and kidney deficiency
yongjun wang, qi shi, jianchun jiang, qin bian, qianqian liang, chenguang li, quan zhou, xuejun cui, sheng lu, chongjian zhou
institute of spine disease, longhua hospital, shanghai university of traditional chinese medicine, shanghai 200032, china
objective: to explore the mechanism of yiqi huayu bushen recipe (yhbr), a compound traditional chinese herbal medicine, in treating cervical syndrome (cs) with qi deficiency, blood stasis and kidney deficiency in rats.
methods: a total of 30 threemonthold female spraguedawley rats were randomly divided into normal control group, untreated group and yhbr group; there were ten rats in each group. the rat model of cervical syndrome with qi deficiency, blood stasis and kidney deficiency was established by combining disease and syndrome models. after onemonth yhbr treatment in yhbr group, all rats were sacrificed. serum, plasma and cervical intervertebral discs were detected and observed by radioimmunology, histopathology, immunohistochemistry, etc.
results: compared with those in the normal control group, rats in the untreated group showed obvious signs of deficiency in vital energy, such as tiredness, ptosis, few movement, bluishpurple tongue and tail and weight loss; the weight of uterus and appendages, and the ratio of cyclic adenosine monophosphate/cyclic guanosine monophosphate were decreased; hemorheological parameters and the expression of alphagranular membrane protein (cd62p) were increased; the content of serum estradiol was decreased. yhbr could improve the above indexes except for the weight of uterus and appendages. he staining showed annulus fibrosus with cracks, diminish of pulposus nucleus, and decrease in the height of intervertebral disc and the thickness of endplate in the untreated group; and yhbr could improve the changes of cervical intervertebral discs, but no obvious changes in endplate. type ⅱ collagen protein (col2a1)was distributed in every part of the annulus fibrosus in normal control group, but was decreased in untreated group; yhbr could increase col2a1 expression in annulus fibrosus as compared with the untreated group. the expressions of col2a1 and tissue inhibitor of metalloproteinase1 (timp1) mrnas were decreased in untreated group as compared with the normal control group (p<0.01); the expressions of col2a1 and timp1 mrnas were higher and matrix metalloproteinase13 mrna was lower in the yhbr group than those in the untreated group (p<0.05, p<0.01).
conclusion: yhbr may improve the condition of cervical syndrome with qi deficiency, blood stasis and kidney deficiency by regulating immune system, coagulation system and endocrine system, and delay the degeneration of cervical intervertebral disc by regulating extracellular matrix and metalloproteases in intervertebral disc.
keywords: yiqi huayu bushen recipe; qi deficiency; blood stasis; kidney deficiency; cervical syndrome; rats
益气化瘀补肾方是施杞教授的经验方。本研究利用气虚血瘀肾虚型颈椎病动物模型，探讨益气化瘀补肾方对气虚血瘀肾虚型颈椎病的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 3月龄spf级sd雌性大鼠30只，体质量（240±20）g，由斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号为scxk（沪）20030003。
1.1.2 主要仪器 全自动石蜡包埋机、组织脱水机和轮转式切片机（德国leica公司，型号分别为eg1160型、tp1020型和rm2135型），光学显微镜和图像分析系统（日本olympus公司，bh20型），紫外/可见光分光光度计（美国beckman公司，du 800/vis型），四通道荧光实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, pcr）仪（澳大利亚cobett公司，rotor gene 3000型），基因扩增仪(德国eppendorf公司，mastercycler personal型)，γ放免计数器（中国科学院上海原子核研究所日环仪器厂，sn682型），流式细胞仪（美国becton dickinson公司，facscalibur型），全自动自清洗血流变仪（北京普利生仪器有限公司，lbyn6c型）。
1.1.3 主要药物和试剂 氢化可的松琥珀酸钠（天津市生物化学制药厂，国药准字h12020493），盐酸肾上腺素（上海禾丰制药有限公司，国药准字h31021062），盐酸氯胺酮（上海第一生化药业公司，国药准字h31021897），益气化瘀补肾方由黄芪15 g、川芎9 g以及补骨脂15 g等组成（上海中医药大学龙华医院制剂中心提供）［1］。中药水煎剂灌胃给药，含生药量0.687 g/ml，1次/d，3 ml/次。雌二醇（estradiol, e2）放射免疫分析药盒（北京北方生物技术研究所），125i环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate, camp）、125i环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate, cgmp）放射免疫分析试剂盒（上海中医药大学核医学实验室），ⅱ型胶原兔抗鼠抗体（美国cell signaling technology公司)，ⅱ型胶原蛋白表达免疫组化试剂盒（晶美生物工程有限公司），聚集蛋白聚糖（aggrecan1, agc1）、ⅱ型前胶原基因（type ⅱ procollagen gene, col2a1）、基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase13, mmp13）和基质金属蛋白酶抑制剂1（tissue inhibitor of metalloproteinase1, timp1）引物（大连浩嘉生物技术有限公司），藻红蛋白（phycoerythrin, pe）标记的鼠抗人血小板表面α颗粒膜糖蛋白（alphagranular membrane protein, cd62p）抗体(英国serotec公司)，trizol试剂（美国mrc公司），逆转录酶（北京天根生化科技有限公司）。
1.2 分组与造模方法
1.2.1 分组方法 将30只大鼠按随机区组设计，分为正常组、气虚血瘀肾虚型颈椎病模型组（简称模型组）和益气化瘀补肾方组，每组10只。
1.2.2 动物模型建立方法 动物模型的建立参照病、证模型复合而成的气虚血瘀肾虚型颈椎病模型［2］，颈椎病造模3个月后，正常组和模型组正常饲养，益气化瘀补肾方组予益气化瘀补肾方治疗1个月，然后统一取材检测。
1.3 指标测定
1.3.1 动物行为和体征的观察 每天观察实验动物的精神、活动、皮毛、尾色、大便，有无缩肩拱背以及觅食等情况，3 d记录1次。
1.3.2 子宫及附件形态和质量测量 动物用戊巴比妥麻醉后，取出子宫及附件，为了与模型组和益气化瘀补肾方组相统一，正常组取出子宫及附件后去除双侧卵巢。先用肉眼观察子宫及附件的形态，再用电子天平称量子宫及附件的质量，每组随机取8个样本，进行统计分析。
1.3.3 血浆camp和cgmp含量检测 动物用戊巴比妥麻醉后，腹主动脉采血1 ml，乙二胺四乙酸抗凝，离心，取血浆，按照试剂盒说明书操作要求，用放射免疫法测定血浆camp和cgmp含量，并计算其比值。实验由上海中医药大学核医学实验室完成。由于实验过程中的意外或失误（其他血液样本同此），使各组样本量分别为7、7、7。
1.3.4 血液流变学指标检测 上述方法采血5 ml，肝素抗凝，摇匀，全自动自清洗血流变仪检测血液流变学变化。模型组有2个样本血液发生了凝固，所以样本量分别为10、8、10。
1.3.5 血cd62p检测 上述方法采血1 ml，肝素抗凝，用流式细胞仪检测cd62p的表达。取0.1 ml抗凝血，加入pe标记鼠抗人cd62p抗体20 μl，混合，4 ℃放置20 min；加2 ml红细胞溶解液放置10 min破红细胞；离心2 000 r/min，5 min，弃上清液；用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline, pbs）洗涤细胞2～3次，再悬浮于0.3 ml pbs中，用流式细胞仪检测cd62p的表达。实验由中国科学院上海生命科学研究院细胞所完成。每组8个样本。
1.3.6 血清雌二醇含量测定 上述方法采血2 ml，离心，取血清，按照试剂盒说明书操作要求，用放射免疫法测定血清e2的含量。各组样本量分别为8、7、8。
1.3.7 椎间盘组织病理学观察 取大鼠颈椎间盘，4%多聚甲醛固定24 h，清水冲洗后，20%乙二胺四乙酸脱钙4周，脱水，透明，包埋，连续6 μm横断面切片，he染色。在光学显微镜下观察每个正中矢状面椎间盘结构。
1.3.8 颈椎间盘ⅱ型胶原蛋白表达的检测 采用免疫组化方法，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。棕黄色为阳性染色，每个标本在200倍光学显微镜下观察。
1.3.9 颈椎间盘agc1、col2a1、mmp13以及timp1基因表达的检测 用trizol法抽提mrna，逆转录后，采用实时荧光定量pcr方法检测基因表达。引物及反应条件参照文献［3］。用6个样本进行统计，结果用待测基因与βactin灰度值的比值表示。
1.4 统计学方法 采用spss 13.0软件进行统计分析，实验数据用x±s表示,组间比较采用单因素方差分析。
2 结 果
2.1 动物行为和体征 正常组大鼠喜动、活动灵活、皮毛光泽、无眼眯（眼睑下垂）和缩肩拱背现象。其余两组大鼠造肾虚模型后，形体逐渐肥胖，少动；在造气虚模型后7 d左右，开始出现倦怠少动、喜卧、皮毛蓬乱无光泽、眼眯和缩肩拱背现象，随着时间的延长症状逐渐加重；造血瘀模型后6～7 d大鼠出现舌质瘀紫，尾色瘀青。益气化瘀补肾方组动物上述行为和体征状态恢复较快。
2.2 子宫及附件形态和质量 模型组和益气化瘀补肾方组与正常组比较，子宫缩小，输卵管变细，质量明显减轻，益气化瘀补肾方组与模型组比较无明显差异。
2.3 血浆camp、cgmp含量和camp/cgmp比值 模型组与正常组比较，血浆camp、cgmp含量及camp/cgmp比值差异无统计学意义；益气化瘀补肾方组与正常组比较，血浆cgmp含量降低（p<0.05），与正常组和模型组比较，camp/cgmp比值增高（p<0.05）。见表1。
2.4 血液流变学变化 与正常组相比，模型组和益气化瘀补肾方组全血低切黏度、全血高切黏度和低切还原黏度均明显增高（p<0.01）；益气化瘀补肾方组与模型组比较全血高切黏度显著降低（p<0.01）；各组间聚集指数差异无统计学意义。见表2。表1 血浆camp、cgmp含量和camp/cgmp比值表2 血液流变学指标变化
2.5 血cd62p表达 与正常组相比，模型组和益气化瘀补肾方组cd62p表达明显增高（p<0.01）。益气化瘀补肾方组与模型组相比，cd62p表达明显降低（p<0.05）。见表3。
2.6 血清e2含量 与正常组相比，模型组和益气化瘀补肾方组血清e2含量明显降低（p<0.01）。益气化瘀补肾方组血清e2含量比模型组增高（p<0.05）。见表4。
2.7 颈椎间盘he染色 正常组颈椎间盘纤维环排列稍紊乱，髓核稍有皱缩，软骨终板潮标清晰可见，关节软骨层较薄；模型组与正常组相比，颈椎间盘高度降低，纤维环出现裂隙，纤维排列紊乱，髓核缩小，软骨终板变薄；益气化瘀补肾方组颈椎间盘高度维持正常，纤维环排列稍紊乱，髓核结构良好，软骨终板变化不明显。见图1。
2.8 颈椎间盘ⅱ型胶原免疫组化染色 正常组ⅱ型胶原在髓核与纤维环以及软骨终板均有分布；与正常组相比，模型组ⅱ型胶原表达减少，主要表现在纤维环；与模型组相比，益气化瘀补肾方组ⅱ型胶原在纤维环的表达有所增加。见图2。 表3 血cd62p的表达表4 血清e2含量
2.9 颈椎间盘agc1、col2a1、mmp13和timp1 mrna表达 与正常组相比，模型组col2a1和timp1 mrna表达降低（p<0.01）；益气化瘀补肾方组与模型组相比，col2a1和timp1 mrna表达增高，mmp13表达降低，差异有统计学意义（p<0.05, p<0.01）。见表5。表5 agc1、col2a1、mmp13和timp1的基因表达
3 讨 论
颈椎病属中医学“筋伤”范畴，无论外邪侵袭还是劳损等病因所致，皆离不开气血的变化。颈椎病的发生发展除离不开气和血外，其与肾的关系亦较为密切。《素问·六节脏象论》曰：“肾者主蛰，封藏之本，精之处也。”所谓精，据《灵枢·本神》所曰“生之来谓之精”，即指先天之精气，也就是肾气，它对人体之生长、发育及形体之盛衰始终起着主导作用。颈椎病发生之相关因素中，椎体骨质增生、骨质疏松都与肾气是否充盈、骨与髓能否得到滋养不无关系。《张氏医通》云：“有肾气不循故道，气逆挟脊而上，至肩背痛。”这里也提出了肾与颈椎病的相关性。大鼠的行为状态，血浆camp和cgmp含量与免疫和代谢功能密切相关，血液流变学和cd62p是血瘀证的重要指标，血清雌二醇含量的减少表示肾功能低下。本实验中，这些实验室指标的测定结果说明模型组大鼠出现了气虚、血瘀、肾虚证的相关病理改变。颈椎间盘形态学、免疫组织化学及分子生物学的变化，证实了模型组大鼠有明显的椎间盘退变。该模型可以用于气虚血瘀肾虚型颈椎病的相关研究。
益气化瘀补肾方由黄芪、川芎和补骨脂等中药组成。黄芪不仅有增强免疫、扩张血管、改善微循环、强心和抗衰老等作用，也具有保护肾脏的作用［4］。川芎为“血中之气药”，其有效成分川芎嗪和阿魏酸等具有清除氧自由基、钙拮抗、扩张血管、抗血小板聚集和抗血栓形成等作用［5］。补骨脂有较强的雌激素样作用［6］，还能通过调节神经和血液系统增强免疫和内分泌功能。可见，益气化瘀补肾方的作用不是单一方面的，而是通过多系统和多靶点发挥治疗作用。实验结果表明，益气化瘀补肾方可以通过免疫系统、凝血系统和内分泌系统改善气虚血瘀肾虚型颈椎病证候的相关指标，增加细胞外基质的基因和蛋白表达，抑制降解酶活性，从而达到延缓椎间盘退变的作用。
【参考文献】
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江建春, 李晨光, 周泉, 卞琴, 梁倩倩, 崔学军, 卢盛, 周重建, 施杞, 王拥军. 益气化瘀补肾方对大鼠肾虚型颈椎病的作用机制. 中西医结合学报. 2008; 6(12): 12801285.
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王拥军, 施杞, 江建春, 梁倩倩, 卞琴, 李晨光, 周泉, 崔学军, 黄敏, 刘清高, 卢胜, 周重建. 大鼠气虚血瘀肾虚型颈椎病模型的建立. 中西医结合学报.2008; 6(11): 11521158.
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