高效毛细管电泳法同时分离测定苏丹红ⅰ、ⅱ号

【摘要】  　　目的采用高效毛细管电泳法（hpce）同时分离及测定苏丹红ⅰ和苏丹红ⅱ。方法利用非涂层弹性融硅石英毛细管75 μm（i.d.）×60 cm为分离通道，优化选择检测波长、缓冲溶液种类、浓度及ph值、运行电压、进样浓度、进样时间等试验参数后进行分离测定。结果在最佳实验条件下：紫外检测波长297 nm,30 mmol/l tris(ph=9.5)缓冲溶液，分离电压15 kv,进样时间20 s，较好地实现了苏丹红ⅰ和苏丹红ⅱ的基线分离及检测。结论该法简便、快速、灵敏度高。

【关键词】  高效毛细管电泳法； 苏丹红ⅰ； 苏丹红ⅱ

　　苏丹红ⅰ～ⅳ是一种人工合成的偶氮类、脂溶性的化工染色剂，其中苏丹红ⅱ，ⅲ和ⅳ均为苏丹红i的化学衍生物。苏丹红ⅰ和苏丹红ⅱ结构式如图1所示［1］。

　　苏丹红作为一种工业染料，被广泛用作染色的原料，但因其具有一定的致癌、致敏性和遗传毒性［2～3］，被国际癌症研究机构(iarc)列为第2类(对动物怀疑有致癌性物质)或第3类致癌物质，因此严禁在食品中使用，我国也明文禁止其作为色素在食品中进行添加［4］。目前国内外食品中苏丹红染料的常用检测方法是高效液相色谱法(hplc)［5，6］，液相色谱/质谱分析法(lc/ms)［7］，薄层色谱-紫外可见分光光度法［8］等。而国内运用高效毛细管电泳法对食品中的苏丹红进行检测未见报道，故此我们建立了毛细管电泳法同时分离测定苏丹红ⅰ和苏丹红ⅱ。

　　1  器材

　　1.1  仪器cl2001高效毛细管电泳仪紫外检测器（北京彩陆科学仪器有限公司）；石英毛细管柱75 μm（i.d.）×55 cm(河北永年光纤厂)；kq520db型超声波清洗器;1810型石英自动双重纯水蒸馏器（江苏省宜兴市石英玻璃仪器厂）。

　　1.2  试剂辣椒粉（广西南宁）；苏丹红ⅰ、苏丹红ⅱ（97%，a johson matthey company）；三（羟甲基）氨基甲烷(tris，国药集团化学试剂有限公司，b.r.)；硼酸(gb)（a.r.中国上海试剂总厂）；其他为分析纯试剂；水为实验室自备二次蒸馏水。

　　2  方法
   
　　分别准确称量0.000 5 g苏丹红ⅰ和苏丹红ⅱ，甲醇溶解后再分别定容至10.00 ml，配制成50.0 mg/l的苏丹红ⅰ和苏丹红ⅱ的单标储备液；分别准确称取0.000 5 g苏丹红ⅰ和苏丹红ⅱ于同一烧杯中，甲醇溶解后定容至10.00 ml，配制成50.0 mg/l的苏丹红ⅰ和苏丹红ⅱ的混合储备液。
   
　　取干燥辣椒粉末，准确称量1.000 0 g加30.0 ml甲醇，超声波提取30 min,冷却后减压抽滤，取滤液用甲醇定容至50.00 ml，摇匀，作为供试液。避光保存于冰箱中待用。
   
　　所有溶液进样前先用0.45 μm微孔滤膜过滤。

　　3  结果与讨论

　　3.1  检测波长的选择采用紫外-可见分光光度计分别对苏丹红ⅰ、ⅱ号的甲醇溶液进行扫描，得到苏丹红ⅰ、ⅱ的最大紫外吸收波长都为228 nm。本实验探究了216，228，254，297，332，478，491 nm等7个检测波长，结果显示在297 nm的检测波长下苏丹红ⅰ、 ⅱ的分离效果较好，因此选用297 nm作为分离检测波长。

　　3.2  缓冲体系的选择实验探讨了硼砂-硼酸，tris-cit, tris-硼酸，tris- nah2po4，磷酸盐等缓冲体系对分离的影响。结果表明tris-硼酸体系能够得到较好的分离效果。

　　3.3  ph值的影响ph值是影响分离度的一个重要因素。在30.0 mmol/l tris中分别加入硼酸调节ph值为8.00，8.50，9.00，9.50，10.00的缓冲体系。结果显示采用ph值为9.50的30 mmol/l的tris-硼酸缓冲体系能获得较好的分离。

　　3.4  缓冲溶液浓度的选择增加缓冲溶液的浓度，离子浓度增大，改变缓冲容量，减少溶质和管壁之间物质的作用，从而改善分离效果。缓冲溶液的浓度过大将产生大量的焦耳热，导致基线不稳，峰形变差。试验探讨了10.0，20.0，30.0，40，50，60 mmol/l这几个浓度的缓冲溶液对分离检测的影响，结果表明30 mmol/l tris（ph=9.50）分离效果较好。

　　3.5  运行电压的选择分离电压的大小不仅影响被测化合物的迁移时间，而且对分离度也有影响。高分离电压可以改善分离度，缩短分析时间。但是电压过高，毛细管内产生的焦耳热不容易散发，将引起柱效和分离度的降低，电压过低则分离时间过长。试验探讨了12，15，18，21，24 kv 5个运行电压，结果表明15 kv分离效果最佳。

　　3.6  进样时间的选择进样时间决定了进样量的大小。进样量太小，达不到检测器的灵敏度；进样量太大，样品塞长度超过扩散引起的区带增宽，使分离效率和分离度变差。实验采取重力进样,探讨了10，15，20，25，30 s 5种进样时间,结果表明，20 s为最佳进样时间。
　
　　3.7  标准曲线及重现性精确配制不同浓度的苏丹红ⅰ号标准样品溶液，以30 mmol/l tris+硼酸为缓冲溶液，运行电压为15 kv，ph=9.50，进样时间20 s，检测波长为297 nm。以峰面积（μv/s）与质量浓度( mg/l)绘制标准工作曲线图，得到线性回归方程为y=17 311x+20 371，r=0.999 4，线性范围为0.05～4 mg/l，检出限为0.05 μg/ml。同法绘制苏丹红ⅱ的标准工作曲线图，得到线性回归方程为y=8 261.1x-78 353，r=0.999 6，浓度在20.00～50.00 mg/l范围有良好的线性关系，检出限为20.00μg/ml。

　　3.8  样品分析优化条件下，利用加标法，分别比较确认苏丹红ⅰ、 ⅱ号的电泳图，以达到对苏丹红ⅰ、 ⅱ号的定性分析目的。与图2比较，在苏丹红混合溶液中单加苏丹红ⅰ号标准样品， 1号峰峰高明显增加，可推知1号峰为苏丹红ⅰ号；同法，单加苏丹红ⅱ号标准样品，2号峰变高，可推知2号峰为苏丹红ⅱ号。如图3。

　　取提取液在优化的实验条件下，直接进样。如图4。在样品中分别加入一定量的苏丹红ⅰ、ⅱ号标准样品，得到如图4加标电泳图谱。通过分析比较图4、图5可推知图5（b）的2号峰为在辣椒样品里加入的标准品苏丹红ⅱ号的峰，可推知辣椒粉里没有苏丹红ⅱ号。并分别进行加标回收实验，平行测定5次。结果见表1。表1  苏丹红回收率实验（略）

　　4  结论

　　本文建立了同时分离检测苏丹红ⅰ、ⅱ的新方法-高效毛细管电泳紫外检测法。与高效液相色谱方法相比较, 样品处理步骤大大简化, 操作更方便，用于测定辣椒粉,回收率在90%～109%之间，结果令人满意。

【参考文献】
  　　［1］秦 菲.食品中苏丹红的毒性及检测方法［j］. 北京联合大学学报(自然科学版),2008,22(2): 51.

　　［2］宋 雁.食品中苏丹红的危险性评估［j］. 国外医学·卫生学分册,2005,32(2): 129.

　　［3］stiborová m, martínek v, r dlova h， et al. expression of cytochrome p450 1a1 and its contribution to oxidation of a potential human carcinogen 1-phenylazo-2-naphthol( sudan ⅰ) in human livers ［j］. cancer letters, 2005, 220 (2) : 145.

　　［4］米建萍,刘青华,黄 峥，等.食品中苏丹红检测方法的应用进展［j］. 分析实验室，2008,27:427.

　　［5］吴银良，李 存,刘勇军，等.高效液相色谱法快速测定鸭肉和鸭蛋中苏丹红染料［j］. 分析化学研究简报,2008，36（6）：843.

　　［6］罗远宏,邱 巍,李卫岗，等.高效液相色谱法测定禽蛋产品中苏丹红类染料［j］. 理化检验-化学分册，2007，43（11）：913.

　　［7］zhang yan, wu hai-long, xia a-lin, et al. interference-free determination of sudan dyes in chilli foods using second-order calibration algorithms coupled with hplc-dad ［j］. talanta, 2007, 72: 926.

　　［8］庞艳玲，王怀友.薄层色谱-紫外可见分光光度法测定食品中的苏丹红ⅰ号［j］. 分析试验室，2008，27（1）：60.