【摘要】 目的 在重组人骨形态发生蛋白-2(rhbmp-2)诱导异位成骨过程中，局部应用不同浓度的辛伐他汀(sim)，探讨sim对rhbmp-2诱导成骨的作用。方法 ①以牛松质骨为原料经过脱脂、脱蛋白等步骤制备牛骨基质明胶载体,将辛伐他汀和rhbmp-2分别与bmg载体复合;②将45只雄性sd大鼠随机分为3组。a组：高剂量实验组；b组：低剂量实验组；c组：对照组;③将复合体植入大鼠股后部肌袋中，术后15 d、30 d、60 d对实验大鼠进行大体观察、x线检测。结果 ①大体观察：各组组织块均随着时间延长而变硬，范围变大;②x线结果，各组植入部位术后15 d、30 d未见显影，于术后60 d各组可见不同密度的影像，b组和c组钙化明显，成高密度影像；a组成低密度影像。成骨区灰度值a组明显低于b组和c组。结论 高浓度辛伐他汀可明显抑制rhbmp-2的促进成骨作用；低浓度辛伐他汀的抑制作用则不明显；证实了rhbmp-2在促进成骨方面有重要作用。
【关键词】 辛伐他汀；重组人骨形态发生蛋白-2；诱导；成骨；x射线放射学
骨缺损的修复一直是临床的棘手问题。1995年crane［1］系统提出了骨组织工程的概念、引起了广大学者的关注。近几年来，利用骨组织工程的方法构建新生骨组织修复骨缺损成为研究工作的热点，本实验采用sd大鼠股部肌袋模型，以牛bmg为载体，旨在局部应用rhbmp-2促进成骨的基础上，联合应用不同浓度的辛伐他汀，来观察二者之间的异位诱导成骨效应，从而为探索辛伐他汀在成骨方面的作用提供实验依据（促进、抑制或无作用），是否能作为rhbmp-2在促进成骨方面具有协同作用的激活物，亦为进一步探索rhbmp-2在促进成骨方面的机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及试剂 雄性sd大鼠45只，体重180~200 g，动物由辽宁医学院实验动物中心提供。sd大鼠骨髓间充质干细胞，骨基质明胶，系在辽宁医学院完成。rhbmp-2(广州达晖生物技术有限公司)、辛伐他汀（浙江江北药业有限公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 牛bmg载体的制备 取牛股骨下端松植骨去除骨髓、软组织和关节软骨，用大量蒸馏水清洗,参照urist［2］的bmg 制备方法制备牛松质骨bmg。冻干消毒保存备用。
1.2.2 新伐他汀及rhbmp-2与bmg载体的复合 将辛伐他汀用100%酒精配置成15%、2.5%的溶液，将载体浸入上述的含一定量辛伐他汀的酒精溶液中，使药物均匀充分吸附到载体上，热风蒸发酒精，再在室温下自然挥发72 h，环氧乙烷消毒2 h备用。按照实验要求，将rhbmp-2用三蒸水溶解后，采用定量真空抽吸法获得复合材料：含15%辛伐他汀+rhbmp-2 0.25 mg+bmg,含2.5%辛伐他汀+rhbmp-2 0.25 mg+bmg，含rhbmp-2 0.25 mg +bmg 3种复合物,各取15块,冻干后环氧乙烷消毒备用。
1.2.3 动物实验 将45只雄性sd大鼠随机分成3组（每组15只），a组：高剂量实验组（含15％辛伐他汀+rhbmp-2 0.25 mg）；b组：低剂量实验组（含2.5%辛伐他汀+rhbmp-2 0.25 mg）；c组：阳性对照组（含rhbmp-2 0.25 mg）。水合氯醛麻醉后,每只大鼠右侧股部去毛。常规消毒后暴露后股部肌袋。a、b、c组动物分别植入相应载体。仔细缝合肌肉、皮肤,麻醉清醒后送回笼养。于术后15d、30d、60d处死动物，每组每期5只进行实验检测。
1.3 实验结果检测
1.3.1 大体观察 对术后第15、30、60天的sd大鼠进行组织块硬度、范围及肢体运动情况的观察。
1.3.2 x线观察术后第15、30、60天，处死sd大鼠后立即采用specimen radiography system(faxitron x-ray corporation)进行摄片，投照条件为球管电压30kv，曝光时间3s，电流强度自动，并采用acr2000i系统合成数码x线图像，应用cais-1000图像分析软件对成骨区域灰度值进行测量。
1.4 统计学处理 实验所得数据以均数±标准差（x±s）表示。采用spss 13.0软件进行多样本均数的方差分析。p>0.05认为差异有显著性。
2 结果
2.1 大体观察 术后3组sd大鼠均有死亡，其中a组无死亡，b组死亡2只（术后2d及6d各一只），c组死亡5只（术后第2天二只，第3天一只，第5天一只，第20天一只），均按照相应实验条件予以补充。术后第15天，各组于股后部植入处均可扪及新生硬组织；术后第30天，b组、c组新生硬组织范围变大，硬度增加，a组则无明显变化；第60天，b组、c组组织硬度及范围进一步增加，且c组组织硬度大于b组，a组硬度有所增加，但不及b、c两组。
2.2 x线检查 术后15 d、30 d各组大鼠的x线均未见任何影像(图1a)；术后60 d，b组和c组两组sd大鼠右侧股后部均可见明显高密度影，钙化明显，部分接近sd大鼠下肢皮质骨密度。其中c组对照组成骨面积较大，占据股后部间隙，实验组b组成骨面积较小，同时成骨区灰度值c组：（195.4±8.4）明显高于b组：（152.8±9.8）(p>0.01)。a组15只sd大鼠右侧股部肌袋内可见低密度钙化影，其成骨区灰度值：（46.58±10.4），明显低于b组和c组(p>0.01)。(图1b、1c、1d)。
3 讨论
有研究表明他汀类药物还具有免疫抑制作用。普伐他汀可以减少移植区域非特异性炎症,预防早期同基因胰岛移植的失败,与环孢素合用降低慢性肝移植的排异发生率［3］。而在同基因心脏移植模型中,普伐他汀［4］可以抑制胞外基质蛋白的合成及随之的降解,阻止巨噬细胞对移植器官的浸润,从而抑制导致同基因心脏移植失败的主要原因之一进行性慢性血管排异反应。他汀类药物对免疫细胞有较广泛的抑制作用,可降低排异反应的发生率。本实验当中虽没有对免疫方面做过专门的研究，但实验中sd大鼠的死亡情况及数量不排除免疫反映的可能。实验中c组共死亡5只（其中一期死亡4只，二其死亡1只），b组共死亡2只且全部在一期，而只有a组无一例死亡，说明实验动物可能对实验所用的bmg载体及rhbmp-2产生了排斥反应，而b组、c组随着辛伐他汀的应用，且质量浓度的提高，可能降低了bmg载体及rhbmp-2所带来的排斥反应，这与以前的实验结果相符合，但还需要进一步的论证。
oxlund等［5］观察了辛伐他汀对骨组织在生物力学强度上的影响。对雌性成年大鼠辛伐他汀灌胃3个月后，用显微镜ct扫描观察及材料测试仪测试腰椎横断面，提示辛伐他汀组松质骨量及抗压强度较对照组明显增加，对皮质骨则影响甚微。表明辛伐他汀通过抑制破骨细胞活性减少了骨量丢失。他汀类药物不仅能够刺激骨形成，而且对骨吸收及改建也有影响，它参与调控骨代谢的整个过程，进而增加骨生成量、增强骨质强度。杜建层等［6］研究指出，他汀类药物提高成骨细胞bmp-2表达和il-6水平，表明对骨代谢有着促进生成和抑制吸收双重作用。
总之,目前对于他汀类药物对成骨作用的影响尚存不同观点。有的实验认为他汀类药物对成骨有抑制作用；有的体内外实验认为,他汀药物可以促进骨形成,可能影响骨吸收,提高骨密度及骨代谢指标。因此,体内给药研究他汀类药物对正常或骨质疏松模型动物骨代谢影响的实验结论同样存在分歧,但是部分他汀药尤其是辛伐他汀和洛伐他汀等对骨代谢确有一定的影响,实验结论的不同或许与动物的选择及给药剂量、时间、方式的差异有关。
参考文献
［1］ crane gm, lshaug sl, mikos ag, et al. bone tissue engineening.nature medicine, 1995,1(12):1322.
［2］ urist mr. bone formation by autoinduction.science,1965, 150:893.
［3］ kakkis jl, ke b, dawson s, et al. pravastatin increases survival and inhibits nk cell enhancement factor in liver transplantation rats. j surg res, 1997,69(2):393-398.
［4］ maggard ma, ke b, wang t, et al. effects ofpravastatin on chronic rejection of rat cardiac allografts.transplantation,1998,65(2):149-155.
［5］ oxlund h,dalstra m,andreassen tt.statin given perorally to adult rats increases cancellous bone mass and compressive strength.calcif tissue int,2001,69:299-304.
［6］ 杜建层，周秀芹，庞义存，等.辛伐他汀对去卵巢大鼠血清il-6、igf-ⅰ及成骨细胞bmp-2表达的影响.中国老年学杂志，2005，25：442-444.
