【摘　要】目的：建立大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细菌生物膜（bbf）的模型，考察注射用双黄连对bbf形成的影响及抑制作用。方法：在特定的条件、方法下分别对细菌单独培养和细菌与提取物共同培养，通过酶标仪测量其od值来考察bbf的生长能力。结果：注射用双黄连对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌bdf的形成均有抑制作用。

    【关键词】双黄连；细菌生物膜；影响

    建立大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细菌生物膜（bbf）的模型，考察注射用双黄连对bbf形成的影响及抑制作用。

    1　bbf模型的建立

1.1　大肠杆菌bbf模型的建立1.1.1　菌种的复活将大肠杆菌冻干粉加入0.4mlnb培养基溶解后，放入37℃恒温振荡器（230～240转/分钟）中培养8小时，分装在离心管中，加入0.5ml的50%甘油，置于液氮中，于-80℃冰箱中冷藏保存。

    1.1.2　大肠杆菌bbf模型建立的方法将置于-80℃冰箱中的大肠杆菌划线于nb培养基的平板上，置于恒温培养箱中，于36℃培养24小时。挑取平板上的单一菌落溶于5mlnb液体培养基中，于36℃恒温振荡器中振荡8小时，得到单克隆细菌增殖培养的菌液，备用。

    将菌液稀释100倍置于96孔板中，四周为nb培养基作为空白。置于恒温培养箱中，于36℃培养24小时，取出。将菌液倾出，用蒸馏水反复清洗后，加入0.1%结晶紫染色30分钟后，将结晶紫倾出，洗净，加入1%脱氧胆酸钠溶液，30分钟后，测其600nm处的od值。以菌液浓度为横坐标，以od值为纵坐标，考察bbf生长情况。

    1.2　影响大肠杆菌bbf生长的因素通过实验的反复摸索，我们发现影响大肠杆菌bbf生长的因素主要有以下几种：①菌种：不同的大肠杆菌菌株对bbf的影响很大，直接影响到bbf的生长与否和bbf形成的好坏。且大肠杆菌传代越多，bbf的生长情况越不好，故我们每次实验均采用大肠杆菌的第二代菌株。

    ②96孔板的材质：不同的细菌在不同材质的96孔板上的生长情况是不同的。我们选用了市场上常见的三种96孔板分别是进口聚氯乙烯（pvc）板，国产聚苯乙烯（ps）板，进口聚苯乙烯板，大肠杆菌分别在不同材质的96孔板上培养。结果，大肠杆菌在国产ps板上的生长情况是最好的。

    ③培养时间：考虑到实验操作时间的可行性，我们选定将大肠杆菌分别培养18小时、24小时、36小时，考察bbf的生长情况。结果，大肠杆菌在培养24小时后，bbf的生长情况最好。

    1.3　金黄色葡萄球菌bbf的建立及影响因素金黄色葡萄球菌的bbf模型的建立方法基本上与大肠杆菌的相同。在这里就不做详细的介绍。我们仍旧分别考察了96孔板的材质、培养时间及菌液浓度等因素，最终确定金黄色葡萄球菌菌液稀释100倍、于国产ps板上培养24小时，bbf的生长的最好且稳定。

    2　注射用双黄连对bbf的影响

2.1　培养方法的建立我们建立两种方法分别考察药物对bbf形成的影响及对bbf的抑制作用。96孔板的点样方法1：四周为菌液（nb培养基）。b行加入180μl菌液（nb培养基），c～g行每孔各加入100μl菌液（nb培养基），b行每孔用移液枪加入20μl药液，混匀，用多通道移液枪从b行吸出100μl移入c行，混匀，再从c行吸出100μl移入d行，依此类推至h行，吸出100μl后，弃去。即从b～h行药液浓度以2倍递减。96孔板的点样方法2：四周为菌液。b～g行加入100μlnb培养基，b行每孔用移液枪加入100μl药液，混匀，用多通道移液枪从b行吸出100μl移入c行，混匀，再从c行吸出100μl移入d行，依此类推至h行，吸出100μl后，弃去。即从b～h行药液浓度以2倍递减。

    培养方法一：考察对bbf形成的影响。

    按“96孔板点样方法1”完成后，依照“大肠杆菌bbf模型建立的方法”中置于恒温培养箱中，于36℃培养24小时，以药液浓度为横座标，以平均od值为纵坐标，作图，考察对bbf形成的影响。

    培养方法二：考察对bbf的抑制作用我们先将96孔板全部点菌液，依照“大肠杆菌bbf模型建立的方法”置于恒温培养箱中，于36℃培养24小时，取出，此时bbf已经形成，将菌液倾出，按“96孔板点样方法”，将培养基培养24小时，以药液浓度为横座标，以平均od值为纵坐标，考察对bbf的抑制作用。

    2.2　考察对bbf形成的影响

图1注射用双黄连对大肠杆菌bbf形成的影响

将注射用双黄连加水溶解，配制成5mg/ml的药液，分别进行对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养的操作。注射用双黄连对大肠杆菌bbf形成的影响结果见图1所示。

    3　讨论

1）通过实验摸索，建立了可靠而稳定的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细菌生物膜（bbf）的模型，确定了影响因素。

    2）96孔板清洗方法的摸索：96孔板的材质是bbf模型能够成功建立的重要因素，确定96孔板的清洗方法：先在96孔板内加注洗液，浸泡3～5分钟后，用手握持96孔板，甩干孔内液体；再用乙醇浸泡24小时后超声20分钟，自然晾干，即可。

    3）考察了注射用双黄连对bbf形成的影响。得出注射用双黄连对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌bbf的形成均有明显的抑制作用。

    4　结语

本实验建立了可靠而稳定的bbf模型，并通过此模型考察了中药注射用双黄连对bbf形成的影响，筛选出能够抑制或破坏bbf形成的活性成分，为从中药中开发治疗慢性感染性疾病的新药提供新的筛选模型，为科学、客观评价中医药在治疗慢性感染方面的作用提供了新的方法。

    参考文献

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