作者：程梅 吴玉龙 贺秀香 徐仁华 孙丽红
【摘要】 目的 研究肝细胞生长因子受体编码基因cmet在大鼠胰腺发育不同阶段的表达。方法 采用高密度寡核苷酸芯片对孕12.5 d（e12.5）、孕15.5 d和孕18.5 d、新生、成年胰腺进行基因转录水平分析，并用rtpcr技术验证基因在大鼠胰腺不同发育时期的表达。结果 cmet基因在e15.5、e18.5较成年特异性高表达。经rtpcr验证，cmet基因表达趋势与芯片结果相符；与芯片cmet探针所用引物不同rtpcr，结果却在各发育阶段呈现与芯片不同的表达趋势。结论 提示cmet可能在胰腺发育过程中起到调控作用，参与胚胎胰腺发育中晚期细胞功能完善的信号传导过程。并且cmet在胰腺发育中发挥作用有可能存在不同转录本。
【关键词】 肝细胞生长因子受体编码基因 cmet 胰腺生长发育 高通量寡核苷酸芯片 rtpcr
【abstract】 objective to investigate the function of cmet in the different development stages of rat pancreas . methods using gene chip expression set230a to detect the signal value of different development stages of rat pancreas:e12.5，e15.5，e18.5，newborn，adult.using rtpcr to verify the results .using another rtpcr to detect different transcription of cmet. results cmet express highly at rat embryonic day 15.5，18.5. the cmet expression trendency of gene chipsis consistent with result of rtpcr .but different primer of rtpcr of have another result.conclusion cmet protooncogene may plays a role in the function maturation stages of rat pancreatic development. there may be different transcriptions of cmet in the progression of rat pancreatic maturation.
【key words】 cmet， pancreatic development， gene chips， rtpcr
胰腺发育是一个复杂的过程，胰岛结构的形成和生物学功能发挥是一个重要环节。大鼠胚胎胰腺发育分为三个阶段：①12.5 d胰腺由胰腺上皮和间充质细胞组成；②胚胎15.5 d左右由胰腺上皮细胞分化而来的内分泌细胞开始突破基底膜向间充质迁移并逐渐相互聚集黏附；③胚胎18.5 d左右基本形成了典型的胰岛结构［１］。完整的胰岛结构是胰腺发挥正常生物学功能的基础，了解完整胰岛结构的形成过程及功能完善调控机制对糖尿病发病机制及治疗的研究有着重要的基础理论和应用价值。
目前，尽管对胰腺胚胎发育的研究在形态学上已明确，但分子网络调控机制上却尚不明晰［２］。功能学研究已经证实在胰腺的整个发育过程中信号通路和转录因子起着非常重要的作用，如fgf, hedgehog, notch，tgfβ/activin等信号通路以及nf1 (tcf1 ),hnf1β(tcf1β), hnf4 (tcf4 ), pdx1, neurod1,ngn3, pax4, pax6等转录因子［３，４］。胰岛结构形成是一个受细胞黏附及迁移等多因子调控的过程［5，6］。
本文以sd大鼠为模型，选取e15.5 d、e18.5 d及新生这三个大鼠胰腺发育和细胞功能完善的关键时期，通过affymetrix高通量多聚寡核苷酸芯片及rtpcr技术对cmet基因在胰腺发育不同阶段的表达做出初步分析。为揭示cmet基因在胰腺发育细胞功能完善过程中的作用提供了一定依据。
1 材料与方法
1.1 材料 成年sd大鼠60只，雌20只，雄40只，体质量250 g左右，由南京医科大学动物中心提供。gene chip murine genome rae230a 芯片(affymetrix 公司)。mastercycler pcr 仪(eppendorf公司), trizol reagent(美国gibco公司) , rnaeasy mini kit (qiagen) , rtpcr试剂盒(tayobo)。
1.2 方法
1.2.1 组织取材：于6:00时，将雌雄以1∶2合笼，次日检测有阴栓者，定为受精0.5 d(e0.5) ，取e12.5，e15.5和e18.5胚胎胰腺以及新生鼠胰腺；取怀有胚胎e12.5、e15.5和e18.5的母鼠，引颈处死，分离出胚胎，显微解剖镜下用显微镊子取出胰腺后，迅速在液氮中冷冻。新生和成年鼠直接分离出胰腺［7］ 。
1.2.2 胰腺发育各阶段芯片制备：用trizol mreagent提取大鼠e12.5、e15.5、e18.5、新生和成年胰腺总rna，利用 rnaeasyminikit纯化总rna。寡核苷酸芯片分析mrna表达：分别以15 μg e15.5和e18.5胰腺总rna为模板合成双链cdna，采用bioarraytm high yieldtm rna tran script labeling kit 体外转录生成生物素标记的crna；再经纯化和片段化处理后，取30 μg crna gene chip murine genome rae230 a芯片杂交；洗脱后，用链酶亲和素藻红蛋白进行染色扫描检测信号；对获得的信号在微阵列分析软件(the microarray suite software version 5. 0)上进行数据分析并对样品的表达结果采用线性度量(scaling)的方法在样品间进行校准。
1.2.3 rtpcr扩增: 根据基因文库cmet的序列，用primer 5.0 设计pcr扩增引物。引物1（同affymetrix芯片引物）:上游引物: 5′ccaccccaatgttctctac 3′,下游引物: 5′ggtggtgaacttttgcgtct3′，预计扩增产物298bp；引物2（靠近5′端编码区）:上游引物：5′gttcaccac caagtcaga3′，下游引物: 5′cttgcgatgaataca3′ ，预计扩增产物257 bp。引物由江苏赛百盛基因有限公司合成。 取1 μg的e15.5, e18.5,新生和成年四个时期（每组5只）胰腺组织总rna进行反转录：反应条件为 30℃ 10 min，42℃ 20 min， 99℃ 5 min， 4℃ 5 min，合成cdna。
cmet的pcr条件：
引物1：94℃ 5min； 94℃ 30 s， 59.5℃ 30 s， 74℃ 1min， 36个循环。
引物2：94℃ 5min； 94℃ 30 s， 51.5℃ 30 s， 74℃ 1min， 35个循环。
rtpcr 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，eb 染色后在紫外光下进行观察照像。用捷达801系列凝胶分析软件进行凝胶密度扫描分析，计算待测基因pcr 产物各条带密度与内对照βactin 条带密度, 两者的比值作为待测基因 mrna表达的相对含量。同一条带重复测量3次。
2 结果
2.1 cmet及其相关调控因子在大鼠胰腺发育过程中的表达信号值及趋势分析 芯片结果显示cmet在大鼠胰腺发育各关键时期的表达信号值，cmet基因于胚胎15.5 d和18.5 d出现特异高表达。同时cmet的转录调控基因和信号传导通路相关基因在胚胎15.5 d和18.5 d也较新生和成年特异性升高（表1）。转录调控基因和信号传导通路相关基因的趋势分析与cmet呈高度一致性（图1）。表1 cmet基因及转录调控基因在大鼠
2．2 cmet rtpcr结果比较 根据基因文库cmet基因序列设计引物所做rtpcr（图2），与芯片cmet探针相同（位于基因3′端非编码区）的引物的rtpcr，cmet表达与芯片中的趋势一致（图3）；而针对cmet基因5′端编码区设计引物所做rtpcr结果与芯片结果出现明显差异（图4），趋势分析在胚胎15.5 d和18.5 d较新生和成年表达量明显降低。
3 讨论
近年来，肝细胞生长因子受体cmet是作为介导肝细胞生长因子hgf所引起hgf/cmet信号传导途径的关键因子，受到越来越广泛重视。编码cmet蛋白的基因最先被发现是作为一种原癌基因，cmet蛋白不同亚型异常表达与多种肿瘤的发生、发展密切相关［８］。cmet是位于细胞膜表面的跨膜受体，属于酪氨酸蛋白激酶受体家族，由原癌基因cmet编码。在人类该基因全长为6 641 bp,存在不同转录本，1989年giordano等研究发现cmet蛋白由α和β亚基组成，有190 kd及170 kd两种蛋白亚型及降解产物，介导cmet受体活性的酪氨酸磷酸化位点位于其β亚基［9］。大鼠该基因全长4 189 bp,编码形成的cmet蛋白与人类的cmet蛋白具有高度的同源性。2004年atsushi suzuki等用流式细胞仪在成年小鼠胰腺导管上皮细胞检测到cmet蛋白的表达［10］。而该蛋白在胰腺发育不同阶段的表达，未见明确报道。
本实验室应用显微分离及提取技术获得胰腺发育及功能完善不同阶段的胰腺组（e12.5、e15.5、e18.5、新生及成年），利用国际上芯片技术最成熟的affymetrix公司的大鼠基因组表达谱芯片，检测大鼠胰腺发育各关键时期的基因表达谱；用生物信息学方法分析具体基因的表达情况，充分显示了胰腺发育过程中基因表达的时空特异性。基因芯片涵盖了15 923条基因和est，其中59％的基因在e12.5有表达，65％的基因在e15.5有表达, 63％的基因在e18.8有表达, 53％的基因在新生胰腺中有表达, 38％的基因在成年胰腺中有表达。在大鼠胰腺的发育过程中，早中期以细胞分化为主，而后期则是以细胞功能成熟为主，我们的基因芯片数据及相关功能分类结果与胰腺发育的形态学过程相符合。从e15.5到e18.5直至出生是胚胎胰腺细胞分化、具有基本生物学功能的阶段［11］。这个时期分化成熟的内分泌细胞进一步向功能细胞完善，外分泌腺泡结构逐渐清晰。
cmet这一基因在我们基因芯片表达谱中的表达也发生了e15.5、e18.5的持续高表达，与我们通过各时期基因表达谱分析得出的结论相呼应：从e15.5到e18.5直至出生是胚胎胰腺功能完善和成熟的阶段。因此，可以推断，cmet可能在胰腺发育过程中发挥调控作用。进一步分析五张胰腺发育基因芯片中cmet上游调控因子的表达发现：这些cmet基因上游调控因子如tge、smad、notch等的也在大鼠胰腺e15.5、e18.5 d出现特异性高表达；所有这些cmet基因相关因子在大鼠胰腺发育整个过程中的表达趋势与cmet基因存在高度一致性。进一步提示了对cmet 基因在胰腺发育调控作用的猜测。
cmet 的转录调控因子中，基因芯片检测到在胰腺发育过程中起作用的有：正向调控因子tgf、sp1、smad及自身反向调控环路因子notch。在肾上皮细胞tgf可诱导cmet 的表达，sp1（ubiquitous special protein）与smad蛋白形成的复合体通过tgf共同作用参与调控cmet基因的转录［12］。erg又可作用于sp1，发挥cmet 转录表达的间接调控作用［13］。有人在细胞水平研究发现，notch激活后引起cmet 转录的下调，cmet本身又可作为notch的刺激因子，反过来增强notch的表达［14］。基因芯片检测到这些因子在胰腺发育过程中的动态表达，与cmet 的表达趋势高度一致，说明在胰腺的发育中存在这些因子对cmet的调控，并且这种调控可能具有时空特异性。
芯片所用探针位于cmet基因靠3′端区域，针对该端设计引物rtpcr结果与芯片一致（图4）。cmet由于剪接位点不同，人上皮细胞可表达多种cmet转录本，最终翻译成不同的cmet变异体［15］。我们针对该基因5′端区域设计引物做rtpcr，表达趋势与芯片完全相反(图5)，胚胎15.5 d和18.5 d的表达量较新生和成年特异性降低。初步提示cmet在胰腺发育功能完善过程中发挥作用也有可能存在不同转录本，不同的转录本间可能存在负向调控作用。
综上所述，胰腺发育是一个全面、整体、动态的过程，我们实验室利用高通量基因芯片形成胰腺发育的动态基因表达谱，研究某一特异基因在基因网络中的调控作用，探讨该基因在胰腺发育各关键阶段的表达。为进一步确定该基因及其编码蛋白产物在胰腺发育过程中的作用及可能的作用途径提供试验依据，肝细胞生长因子受体编码基因在大鼠胰腺发育完善的关键阶段特异高表达，补充了以往研究中信号通路对早期胚胎胰腺发育的调控［16］，丰富、完善了胰腺发育的网络调控学说。为临床糖尿病及其他胰腺疾病的研究及治疗靶点提供基础理论支持。
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