作者：韩笑峰 吕丽 葛汝丽 唐荣华 

【摘要】  目的 探讨β�驳矸垩�蛋白(amyloid beta�瞤eptide, aβ)诱导小胶质细胞活化后κ轻链核因子(nuclear factor�瞜appa b, nf�拨蔮)的表达及一氧化氮(no)水平的变化。方法 aβ干预纯化培养的小胶质细胞，观察其形态学变化，采用镉还原法测定no水平，免疫细胞化学方法研究nf�拨蔮的表达。结果 500 nmol/l及1000 nmol/l aβ干预组细胞形态呈“阿米巴样”，细胞核内nf�拨蔮的表达增加（p＜0.05），培养基中no浓度升高（p＜0.05）。结论 aβ激活小胶质细胞nf�拨蔮途径大量合成no，可能参与阿尔茨海默病(alzheimer’s disease, ad)的致病过程。 
【关键词】  β�驳矸垩�蛋白 小胶质细胞 κ轻链核因子 一氧化氮 阿尔茨海默病
    【abstract】  objective  to study the morphological changes of microglial cell activated by amyloid beta�瞤eptide, the expression of nuclear factor�瞜appa b increased in nucleus and the levels of nitric oxide in cultural medium. methods  purified microglial cells were intervened by amyloid beta�瞤eptide and the morphological changes were observed . the cadmium�瞨eduction method was used to determine the levels of nitric oxide in culture medium, immunocytochemical method to investigate changes of nuclear factor�瞜appa b. results  there were no statistical significant differences between the experimental group of 100 nmol/l amyloid beta�瞤eptide and the control group (p＞0.05). in the experimental groups of 500 nmol/l and 1000 nmol/l amyloid beta�瞤eptide, microglial cells were bigger, the expression of nuclear factor�瞜appa b increased in nucleus and the levels of nitric oxide were higher in culture medium than control group (p＜0.05).conclusion  the amyloid beta�瞤eptide could participate in the  processes of alzheimer’s disease by inducing microglial cells to excrete nitric oxide.
    【key words】  amyloid beta�瞤eptide，microglial cell，nuclear factor�瞜appa b，nitric oxide，alzheimer’s disease
    阿尔茨海默病(alzheimer’s disease, ad)重要的病理特征之一是纤维状β�驳矸垩�蛋白(amyloid beta�瞤eptide, aβ)在神经细胞外及脑血管壁沉积形成老年斑(senile plaques, sp)。大量研究表明，aβ的沉积在ad发病中起着关键作用，但其神经损伤的具体机制尚不完全清楚，研究提示，一氧化氮(nitric oxide, no)可能与aβ的神经毒性有关。本研究用aβ干预小胶质细胞，观测κ轻链核因子(nuclear factor�瞜appa b, nf�拨蔮)的表达以及no水平的变化，探讨aβ诱导小胶质细胞合成no的机制。
    1  材料和方法
    1.1  材料
    1.1.1  动物：出生3 d内的wistar大鼠，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。
    1.1.2  试剂：dmem/f12培养基、胎牛血清（购自hyclone公司），aβ1��40、aβ1��42（购自sigma公司），胰蛋白酶、tritonx��100（购自amresco公司），小鼠抗大鼠cd11b单克隆抗体（购自serotec公司），兔抗nf�拨蔮 p65 多克隆抗体（购自santa cruz公司），抗小鼠及抗兔sp试剂盒和dab显色试剂盒（均购自北京中山生物技术有限公司）。
    1.2  方法
    1.2.1  小胶质细胞分离、培养：在无菌条件下取出新生wistar大鼠的大脑，剥离脑膜，取大脑皮层，剪成0.5 mm3碎块，加入1 ml 0.125%胰蛋白酶室温消化，用100目不锈钢筛网过滤，离心，弃上清，加入dmem/f12培养基重新悬浮细胞，接种于多聚赖氨酸包被的50 ml培养瓶中，置于37℃、含5%co2、20%o2饱和湿度的培养箱中培养。原代混合胶质细胞培养7～9 d后，在37℃恒温摇床上以250 r/min振速摇动处理2.5 h，将细胞悬液接种到已放置盖玻片的培养皿中，37℃培养1 h，弃未贴壁细胞，加新鲜培养基，培养5～7 d即可使用。用免疫细胞化学方法标记其特异性抗原cd11 b进行细胞纯度鉴定，小胶质细胞比例占90%以上即符合要求。
    1.2.2  aβ的“老化（aged）”：用无菌三蒸水将ａβ稀释成 0.5×105 nmol/l，37℃孵育 1周，使其变为聚集状态的ａβ［１］。
    1.2.3  小胶质细胞的干预：培养皿中分别加入不同浓度的“老化”ａβ1��40或ａβ1��42，对照组则不加ａβ，继续培养24 h。收集培养基，-80℃保存，备测定no浓度。细胞爬片用甲醛固定15 min，-20℃保存备用。
    1.2.4  免疫细胞化学染色：免疫细胞化学染色采用sp法。第一抗体小鼠抗大鼠cd11b单克隆抗体的稀释度为1∶1 000，兔抗nf�拨蔮 p65 多克隆抗体的稀释度为1∶200，以pbs替代一抗作阴性对照。联苯二胺（dab）显色。nf�拨蔮 p65免疫细胞化学结果判断：在高倍视野下行细胞计数，细胞核有棕褐色颗粒着色为阳性，无棕褐色颗粒着色为阴性。并根据handel等［2］的分级标准半定量：-(＜5% )，+(5%～25% )，++(26%～ 49% )，+++ (≥ 50 % )。
    1.2.5  no测定：采用cortas nk等［3］的镉还原法测定no浓度。用不同浓度的kno3做阳性标准管，无标本管做空白对照。用721分光光度计测定od值。计算标准曲线并换算no浓度。
    1.2.6  统计学处理：数据资料应用sas 6.12版软件进行统计学分析。等级计分结果比较采用ridit分析。计量数据以均数±标准差（x±s）表示，统计分析采用多个均数之间两两比较的snk检验。
    2  结果
    2.1  小胶质细胞鉴定及aβ干预后其形态学变化  经cd11b免疫细胞化学染色，胞膜及胞浆染色的细胞即为小胶质细胞，其纯度达92%(图1a，1b)。正常培养的小胶质细胞的形态特征为：胞体小，呈椭圆形或三角形，具有伸向各个方向的细小突起 (图1a)。aβ干预后小胶质细胞胞体变大，形态不规则。部分细胞有片状突起或伪足，呈“阿米巴样”(图1b)。
    ( → )所标记为小胶质细胞
    图1a  正常培养的小胶质细胞cd11b免疫
    细胞化学反应及其形态(×400)图1b   aβ干预后小胶质细胞cd11b免疫
    细胞化学反应及其形态(×400)
    2.2  aβ干预后nf�拨蔮的表达变化  nf�拨蔮免疫细胞化学染色后，对照组细胞胞浆染色，而aβ干预组细胞除胞浆外，胞核及核周区域亦出现染色(图2a，2b)。等级计分ridit分析，aβ1��42 和aβ1��40 500 nmol/l干预组与对照组比较差异有显著意义 (p＜0.05)，1 000 nmol/l组与对照组比较差异有极显著意义 (p＜0.01)，而100 nmol/l组与对照组比较差异无显著性(p＞0.05)(表1)。相应浓度的aβ1��42干预组与aβ1��40干预组比较差异无显著性 (p＞0.05)。
    图2a  对照组小胶质细胞nf�拨蔮 p65免疫
    组化反应(×400) 图2b  1 000 nmol/l aβ42干预后小胶质细胞
    nf�拨蔮 p65免疫组化反应(×400)  表1  nf�拨蔮 p65免疫细胞化学结果及ridit分析
    2.3  aβ干预后培养基中no含量变化  100 nmol/l aβ1��40、500 nmol/l aβ1��40、100 nmol/l aβ1��42干预组培养基中的no含量与对照组比较无显著差异(p＞0.05)；500 nmol/l aβ1��42、1 000 nmol/l aβ1��40干预组培养基中的no含量与对照组比较显著增高(p＜0.05)；1 000 nmol/l aβ1��42干预组培养基中的no含量增高与对照组比较有极显著意义 (p＜0.01) (表2)。相应浓度的aβ1��42干预组与aβ1��40干预组比较无显著差异(p＞0.05)。表2  aβ干预后培养基中的no含量比较

   3  讨论
    研究证明，no参与了ad的病理过程并发挥重要的作用［4］，但aβ诱导合成no的具体机制尚未完全阐明，guo等［5］报道其与nf�拨蔮的信号转导和基因转录密切相关。
    本实验结果显示， aβ干预小胶质细胞后，核内nf�拨蔮的表达增加，提示nf�拨蔮被激活。nf�拨蔮是普遍存在于细胞浆中的一种快反应转录因子，调控细胞因子、趋化因子、免疫受体、转录因子、氧化应激相关酶以及急性期蛋白等多种靶基因，参与炎症和免疫反应、细胞周期控制与分化、细胞凋亡、感染及应激反应，其在ad的发病机制中具有重要的作用［6］。静息状态下，nf�拨蔮与nf�拨蔮抑制蛋白（iκb）单体结合，以非活性状态存在于胞浆中。在外界因素的作用下，iκb 快速降解，有p50和p65两个亚单位组成活化状态的nf�拨蔮迅速转移入胞核，与靶基因的κb序列结合启动基因转录。
    目前认为，小胶质细胞表面有多种aβ结合的受体：清道夫受体(class a scavenger receptor, sr)、晚期糖化终末产物受体(receptor for advanced glycation endproducts, rage)及甲酰基蛋白受体（formyl peptide receptor�瞝ike 1，fprl1）等，aβ与受体结合后启动第二信使激活nf�拨蔮途径［7～9］，而nf�拨蔮如何被激活尚不清楚。
    可诱导的一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, inos)基因是nf�拨蔮调控的一个重要靶基因，被aβ激活的nf�拨蔮转移入核，结合于inos的启动子区的nf�拨蔮反应元件，诱导inos大量的表达，no产生增多［10］。此与本实验结果一致，低浓度(500～1 000 nmol/l)aβ可激活小胶质细胞致no产生增多。
    no在中枢神经系统的神经传导、记忆和空触可塑性中发挥重要的生理功能，而过量的no可通过多种途径损伤膜性结构、蛋白质及dna，导致神经元坏死或凋亡［11］；亦可介导和放大氧化应激、炎症级联反应，进而选择性损害与学习记忆有关的神经元，促进sp的形成［12］，使ad病理变化进行性发展。可以推论，aβ的神经毒性机制之一是通过激活nf�拨蔮诱导inos过表达而产生超生理剂量的no来发挥的。
    因此，小胶质细胞的aβ�瞡f�拨蔮�瞚nos�瞡o途径，可能在ad过程中起着重要的作用，对此途径进行深入研究，可进一步揭示ad发病机制以及为ad的临床治疗提供理论依据。
【参考文献】
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