摘要】 目的：探讨靶向增强型绿色荧光蛋白（egfp）小发夹结构rna(short hairpin rna，shrna)对耐阿霉素的人乳腺癌细胞(mcf7/adrr)中egfp基因表达的抑制作用。方法：构建针对egfp基因的shrna表达载体，与pcdna3.0 egfp质粒共转染mcf7/adrr细胞，分别用激光共聚焦扫描显微镜(laser confocal scanning microscope, lcsm)和流式细胞术检测干扰效果。结果：瞬时共转染psilencertm 3.1h1 neo egfp shrna质粒和pcdna3.0 egfp质粒后，荧光显微镜观察结果显示mcf7/adrr细胞中发出荧光的细胞数量减少，荧光强度明显降低。流式细胞术检测阳性细胞百分率降低至35.6%，差异有显著性。结论：靶向egfp 的shrna表达质粒能有效而特异抑制egfp在mcf7/adrr中的表达，mcf7/adrr细胞中存在rna干扰现象，为进一步利用rna干扰技术逆转乳腺癌多药耐药性的研究奠定基础。
【关键词】 rnai 绿色荧光蛋白 乳腺肿瘤 shrna表达载体
inhibition of green fluorescent protein expression by short hairpin rna expression vector in human breast cancer cells（mcf7/adrr）
gan huizhu, zhang guizhen, zhang fengchun, bu lisha, yang shaojuan, gao shen, zheng deming.
department of hematology, chinajapan union hospital, jilin university, changchun 130031, china
［abstract］ objective:to investigate whether short hairpin rna expression vector targeting enhanced green fluo in multidrug resistance human breast cancer cells(mcf7/adrr).methods:the shrna expression vector targeting egfp gene was constructed, and cotransfected into mcf7 cells and mcf7/adrr cells with pcdna3.0 egfp. the rnai effects were assessed by laser confocal scanning microscope and flow cytometry.results:in mcf7/adrr cells transient cotransfected with psilencertm 3.1h1 neo shrna and pcdna3.0 egfp expression vectors,lcsm showed that positive percentage of egfp expression was reduced,and fluorescence intensity was depressed significantly.fcm assay showed that positive percentage was significantly reduced to 35.6%(p<0.05).conclusion:shrna expression vector targeting egfp gene could inhibit enhanced green fluorescent protein expression in mcf7/adrr cells effectively and specifically, rna interference exists in mcf7/adrr cell line, which will provide a new strategy for researching the reversal of multidrug resistance by rnai in breast cancer cells.
［key words］ rnai；green fluorescent protein；breast neoplasm；shrna expression vector
rna干扰（rna interference，rnai）是近年来兴起的分子生物学技术，是在研究反义rna作用过程中发现的，首先在华丽新小杆线虫（c.elegans）中证实［1］；是由dsrna（doublestranded rna）介导的基因阻抑现象，由于这是一种在rna水平的基因表达抑制，故称为rna干扰，简称rnai。rnai技术的发展已经成为人类研究基因功能、抗病毒、治疗恶性肿瘤的一种新方法［26］。绿色荧光蛋白（gfp）可作为报告基因、定位标志，并可用于基因转染效率的测定［7］。增强型绿色荧光蛋白（egfp）是绿色荧光蛋白的突变型，所发荧光强度高，通过显微镜可直接观测、快速、简便。本研究构建了针对egfp基因的shrna表达载体，观察其在耐阿霉素的人乳腺癌细胞中对egfp表达的抑制作用。
1 材料与方法
1.1 质粒和细胞株 pcdna3.0 egfp质粒由中日联谊医院基本外科曹宏惠赠；psilencertm 3.1h1 neo sirna表达载体购自美国ambion公司。敏感的和耐阿霉素的人乳腺癌细胞株mcf7/s、mcf7/adrr由上海第二医科大学附属仁济医院张凤春教授惠赠。
1.2 试剂 t4dna连接酶购自美国promega公司；bamh ⅰ和hind ⅲ内切酶购于日本takara公司；质粒抽提试剂盒dna purification system wizardplus sv minipreps购自美国promega公司；siporttm xp1转染试剂购自美国ambion公司；rpmi1640培养基、胎牛血清购自美国gibco brl公司；阿霉素（adm）购自法玛西亚普强公司；g418购自美国sigma公司。
1.3 方法
1.3.1 egfp shrna表达质粒的构建 根据shrna 的设计原则和genebank egfp编码基因的已知序列(genebank nm_001970)，选择特异性shrna靶位点序列，设计egfp基因shrna插入模板寡核苷酸。合成egfp基因shrna插入模板寡核苷酸，退火后形成双链的shrna插入模板寡核苷酸，克隆到psilencertm 3.1h1 neo sirna表达载体，转化大肠杆菌jm109，提取质粒，酶切和测序鉴定，纯化。
1.3.2 细胞培养和转染 mcf7/s、mcf7/adrr细胞用含有10%胎牛血清的rpmi1640培养基，置于37℃、5%co2条件下常规培养。mcf7/adrr细胞培养基中加入1.0 μg/ml的阿霉素维持耐药亚型，试验前2周换用无阿霉素的培养基。取对数生长期的mcf7/adrr细胞，以2×105/孔接种至6孔板中，培养24小时后达到30%～60%充满，将6 μl siporttm xp1转染试剂加入94 μl无血清rpmi1640培养基，终体积为100 μl，混匀，室温孵化5～20分钟；分别将2 μg共转染质粒dna(pcdna3.0 egfp质粒1 μg，干扰质粒1 μg)加入上述稀释物，室温孵化5～20分钟；换用2 ml无血清培养基，加入质粒dna/siporttm xp1复合物；5小时后换用含10%胎牛血清的rpmi1640培养基。实验同时只加入pcdna3.0 egfp质粒对照组和只加入siporttm xp1转染试剂对照组以及阴性对照质粒组。阴性对照质粒是一个编码shrna的环形质粒，其序列与小鼠、人、大鼠基因组序列无同源性。瞬时转染24～48小时后，检测rna干扰效果。
1.3.3 激光共聚焦荧光显微镜检测 将无菌处理的盖玻片放到12孔培养板中，加入转染质粒后的mcf7/adrr细胞，37℃、5%co2孵箱中过夜培养，细胞自然贴附于盖玻片上。然后，将上述制备好的玻片浸入0.01 mmol/l(ph 7.4)pbs中洗3×5分钟，488 nm激发波长的激光共聚焦扫描显微镜下观察转染后绿色荧光的表达变化。
1.3.4 转染效率的判定 在激光扫描共聚焦显微镜下沿垂直与水平经过连续视野计数egfp阳性的细胞数，如果转染效率极低，如低于1%，则计数各孔所有egfp表达阳性的细胞数量，共观察约20个视野，按如下公式计算转染效率。
转染效率＝egfp表达阳性的细胞数计数细胞总数×100%。
1.3.5 流式细胞仪检测 将转染质粒后的mcf7/adrr细胞用pbs洗涤2次，加入600 μl pbs，以未转染细胞作对照，488 nm激发波长用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白的表达。
1.3.6 统计学方法 应用统计学软件spss 10.0进行统计学分析。数据以x±s表示，组间比较采用t检验，p<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 egfp基因shrna表达质粒的鉴定 重组质粒分别用bamh ⅰ和hind ⅲ双酶切，1.5%琼脂糖凝胶电泳结果出现66 bp和4.3 kb条带，与实验设计的egfp基因模板寡核苷酸长度相符，结果见图1。将阳性重组质粒进行dna序列测定，测序结果与实验设计的模板寡核苷酸序列相符，进一步证实egfp基因shrna表达质粒构建成功。
2.2 lcsm检测pcdna3.0 egfp和egfp shrna表达质粒共转染在耐药细胞中的表达情况 mcf7/adrr细胞转染pcdna3.0 egfp质粒后，激光扫描共聚焦荧光显微镜观察发现转染后4小时即可见到部分细胞表达egfp，在4～48小时内表达egfp的细胞数量逐渐增多，在48小时达到高峰，其转染细胞内出现大量明亮的绿色荧光。共转染空载体与pcdna3.0 egfp质粒细胞中egfp的表达不受影响，同时共转染阴性对照质粒细胞内egfp的表达不受影响。而pcdna3.0 egfp和egfp shrna表达质粒共转染后发出绿色荧光的细胞数量明显减少，荧光强度也明显降低，亮度减弱。mcf7/adrr细胞荧光强度为38.34±6.35，阳性细胞百分率为58.53%±0.55%；而同时转染pcdna3.0 egfp质粒和egfp shrna表达质粒的肿瘤细胞绿色荧光产生明显减少，细胞荧光强度为15.85±4.93，阳性细胞百分率为30.13%±0.26%，结果见表1。转染mcf7/adrr细胞预实验发现当质粒dna与转染试剂siporttm xp1 比例为12时egfp表达最强，故采用该优化条件进行egfp干扰质粒转染，对照组egfp表达最强时，测定的转染效率大致为70%～80%。
图1 egfp shrna表达质粒的酶切鉴定（略）
fig.1 identification of psilencertm 3.1h1 neo egfp shrna expression plasmid by restriction enzyme digestion
note:m.dl2000 dna marker;1.egfp shrna expression plasmid;2.egfp shrna expression plasmid digested by bamh ⅰ and hind ⅲ.
表1 激光共聚焦荧光显微镜检测egfp的表达（略）
tab.1 results of egfp expression assayed by lcsm
note:compare with cells transfected with pcdna3.0 egfp plasmid,1) p<0.05. results represent the mean of two or x±s of three separate experiments.
表2 流式细胞术检测egfp的表达（略）
tab.2 results of egfp expression assayed by flow cytometry
图2 流式细胞术检测egfp的表达（略）
fig.2 results of egfp expression assayed by flow cytometry
note:a.mcf7/adrr;b.mcf7/adrr+pcdna3.0 egfp+negative plasmid;c.mcf7/adrr+pcdna3.0;d.mcf7/adrr+pcdna3.0 egfp+shegfp.compared with cells transfected with pcdna3.0 egfp plasmid,*.p<0.05. results represent the mean of two or x±s of three separate experiments.
2.3 流式细胞术检测pcdna3.0 egfp和egfp发夹shrna表达质粒共转染在耐药细胞中的表达情况 流式细胞仪检测绿色荧光的表达，结果显示单独转染pcdna3.0 egfp质粒mcf7/adrr细胞有egfp表达，共转染阴性对照质粒细胞内egfp的表达不受影响；但共转染pcdna3.0 egfp质粒和egfp shrna表达质粒的肿瘤细胞绿色荧光产生明显减少，阳性细胞百分率显著降低，差异有显著意义(p<0.05)，结果见表2、图2。
3 讨论
当21～23 nt短链rna(sirna)导入哺乳动物细胞，引起序列特异性内源性目的基因mrnas的降解和基因表达的有效抑制。rna干扰引发的基因沉默作用是特异的和有效的，sirna对与其同源的基因表达产生作用，而对与其不同源的基因表达不产生作用。对哺乳动物的研究显示，sirna浓度比传统的反义核酸浓度低几个数量级时仍然有效，rnai技术沉默目的基因具有高效、方便而且适用范围广的优点。
rnai作用机制可能为病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些双链dsrna。宿主细胞胞质中的dicer rnasel将dsrna切割成多个具有特定长度和结构的小片段rna，即sirna。这些sirna可能与解旋酶和一些相关因子形成rna诱导的沉默复合体（rnainduced silencing complex，risc）。新形成的复合体与外源性基因表达的mrna进行特异性结合，并诱发宿主细胞针对这些mrna的降解反应，使外源性基因的蛋白表达消失。rnai具有放大效应。被降解的mrna片段及未被降解的完整mrna均可作为引物，在rna依赖的rna聚合酶（rnadependent rna polymerase，rdrp）作用下，合成更多的dsrna。新合成的dsrna进入下一轮rnai循环。
以前报道的许多rnai载体系统都不含有筛选标志，故阳性rnai克隆的筛选非常困难［8］。本研究采用的psilencer3.1 h1 neo载体具有筛选标志，带有新霉素抗性基因，所以可以用g418进行筛选；而在加入800 μg/ml g418稳定筛选时，只有含有mdr1发夹模板序列的克隆生长，并且阳性克隆转染前后生长状态、细胞形态及生长速度均无明显差别。
利用lsfm和流式细胞仪检测pcdna3.0 egfp和egfp shrna表达质粒共转染在耐药细胞中的表达情况。mcf7/adrr细胞转染pcdna3.0 egfp质粒后，激光扫描共聚焦荧光显微镜观察发现在4小时后即可见到部分细胞表达egfp，在4～48小时内表达egfp的细胞数量逐渐增多，在48小时达到高峰，其转染细胞内出现大量明亮的绿色荧光，主要位于细胞核内；而pcdna3.0 egfp和egfp shrna表达质粒共转染后细胞内绿色荧光明显减少、亮度减弱，荧光强度降低，阳性细胞百分率减低，差异有显著性。流式细胞仪结果显示转染阳性细胞比例与激光共聚焦荧光显微镜计算结果大致相符，mcf7/adrr细胞的转染效率达到55%以上。阳性对照egfp shrna表达质粒的转染验证siporttm xp1转染试剂的转染效率符合实验要求，可以用siporttm xp1转染试剂进行发夹shrna表达质粒的转染。同时pcdna3.0 egfp和egfp shrna表达质粒共转染结果表明，egfp shrna表达质粒转染后有效而特异地抑制egfp的表达，故可以作为rna干扰实验的阳性对照，进一步证实基因沉默可引起序列特异性的目的基因表达的抑制。
【参考文献】
1 elbashir s m, martinez j, patkaniowska a et al. functional anatomy of sirnas for mediating efficient rnai in drosophila melanogaster embryo lysare ［j］. embo j, 2001; 20:68776888.
2 yu j y, deruiter s l, turner d l et al. rna interference by expression of shortinterfering rnas and hairpin rnas in mammalian cells ［j］. proc natl acad sci usa, 2002; 99:60476052.
3 kisielow m, kieiner s, nagasawa m et al. isoformspecific knockdown and expression of adaptor protein shca using small interfering rna ［j］. biochem j, 2002; 363:15.
4 brummelkamp t r, bernards r, agami r. a system for stable expression of short interfering rnas in mammalian cells ［j］. science, 2002; 296:550553.
5 paddison p j，caudy a a, bernstein e et al. short hairpin rnas(shrnas) induce sequencespecific silencing in mammalian cells ［j］. genes dev, 2002; 16:948958.
6 paul c p, good p d, winer i et al. effective expression of small interfering rna in human cells ［j］. nat biotechnol, 2002; 20:505508.
7 sui g. a dna vectorbased rnai technology to suppress expression in mammalian cells ［j］. proc natl acad sci usa, 2002; 99:55155520.
8 miyagishi m, taira k. u6 promoter driven sirnas with four uridine 3′ overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells ［j］. nat biotechnol, 2002; 20:497500.
