【关键词】  妊娠

　　人类妊娠是一个复杂而又需机体各部分协调运转的过程。子宫肌层由静息到收缩的机制很复杂，目前还在探索中。妊娠期众多激素的变化引起人们广泛的关注，其中促肾上腺皮质激素释放激素（crh）近年来成为人们关注的焦点。

　　crh是脑肠肽家族中的一种，于1955年最早发现于下丘脑室旁核，之后在许多外周组织中，如免疫和炎症细胞、心脏、骨骼肌、甲状腺、皮肤、生育组织中发现了它的存在［1～3］。胎盘是妊娠期母体crh的主要来源。人们发现母体血浆crh水平随着妊娠继续而逐渐升高，分娩前达到高峰，产后迅速下降；早产患者的crh峰较正常妇女提前，提示母体血浆crh水平与分娩密切相关［4］。crh可能通过与雌激素、肾上腺皮质激素、前列腺素和缩宫素等的相互作用，建立分娩启动的正反馈环［2，5］。在妊娠子宫宫底部crh发挥收缩作用，而在下段舒张子宫平滑肌，这可能与受体和（或）传导通路不同有关［6，7］。本研究通过对子宫下段平滑肌层中crh受体和（或）亚型的研究，进一步揭示crh在分娩过程中的作用机制。

　　1  对象与方法

　　1.1  研究对象  （1）宫缩组：随机抽取足月因产科因素行剖宫产、已有宫缩者，排除合并恶性肿瘤者，共15例，平均27.55（24～36）岁。（2）无宫缩组：随机抽取足月因产科因素行剖宫产、无宫缩者，排除合并恶性肿瘤者，共14例，平均30.64（25～41）岁。（3）未妊娠组：随机抽取因子宫肌瘤行子宫切除患者，排除合并恶性肿瘤者，共15例，平均46.59（40～54）岁。

　　1.2  主要试剂与仪器  无水乙醇（上海试剂一厂），三氯甲烷、异丙醇（中国医药上海化学试剂公司），焦炭酸二乙酯（depc）、trizol（上海华舜生物公司），dntp、oligo(dt)（上海生工生物工程有限公司），m-mlv反转录酶、tap dna聚合酶（promega公司），核糖核酸酶抑制剂（takara公司），milli-q纯水制备装置（millipore公司），pcr仪（eppendorf公司），dna电泳槽（wealtec公司）。

　　1.3  主要溶液的配制  （1）depc-h2o:双蒸水1000ml加depc 1ml，37℃摇动过夜，然后高压灭菌。（2）75%酒精：125ml depch2o加 375ml无水乙醇，混匀至终体积500ml。（3）50×tae电泳缓冲液：tris 242g、100ml 0.5mol/l edta（ph=0.8），加冰醋酸57.1ml，用蒸馏水定容至1000ml，临用前按需用蒸馏水稀释成1倍的工作液。

　　1.4  研究方法

　　1.4.1  子宫标本的收集  （1）于子宫下段切口正中上缘切取适量新鲜子宫肌层标本放入经过depc水处理的10ml离心管（冰中）内；（2）每个离心管内加入2ml trizol；（3）于1h内用电动匀浆机匀浆（冰浴中操作），26000rpm持续15s以彻底裂解组织；匀浆液于-80℃保存，待提取rna。

　　1.4.2  总rna的提取及浓度测定  （1）总rna的提取：按照上海华舜生物公司trizol reagent操作说明书进行。①室温溶解组织匀浆液：将组织匀浆液1ml移至1.5ml离心管，室温静置8min；②各管加入0.2ml三氯甲烷；③用力颠倒混匀，室温静置8min；④4℃，12000×g离心15min；⑤将上清液小心移至另一个1.5ml离心管；⑥各管加入等体积异丙醇，振荡，室温静置10min；⑦4℃，7500×g离心15min；⑧小心弃上清液，各管加入75%乙醇1ml；⑨充分洗涤，4℃下7500×g离心10min；⑩弃上清液，空气中干燥15～20min；各管加入20μl depch2o溶解rna。（2）总rna纯度和浓度测定：采用紫外分光光度法，测定rna样品在波长260nm和280nm的紫外吸收值。根据od260为1时相当于rna 40μg/ml确定rna的量，根据od260/od280的比值来判断rna样品的纯度，比值位于1.8～2.0之间视为rna纯度优良。总rna抽提后，行rna甲醛变性凝胶电泳，观察18s、28s rna的完整性及二者比例，来判断rna的完整性。

　　1.4.3  rtpcr方法  （1）反转录（reverse transcription,rt）：按照promega公司反转录酶mmlv操作说明书合成cdna第一链：①取2μg总rna和1μg oligo（dt）分别放入同一个1.5ml离心管中；②70℃水浴5min；③冰上急冷3min；④各管分别加入10mm dntp 1.25μl、mmlv 1μl、rna酶抑制剂0.75μl、反转录缓冲液5μl；⑤用depch2o补齐至总体积为25μl，震荡、混匀后，离心；⑥42℃水浴60min；⑦70℃水浴15min；⑧-20℃保存备用。（2）pcr反应：利用pcr引物序列crhr1α（sense：5tccgctacaataccaacaa,antisense:5gccgcagaaagaggacaaa,扩增产物理论值约207bp）、crhr2（sense:5agaatgcttggagaatgggacg,antisense:5acgacaagggcgatgcggta，扩增产物理论值约171bp）、gapdh（sense:5gacacccactcctccacctttga,antisense:5ctctcttcctcttgtgctcttgc，扩增产物理论值约189bp），测定有宫缩、无宫缩及未妊娠子宫下段平滑肌crh受体和（或）亚型mrna的表达水平。（3）反应体系（25μl）：dh2o 15.6μl；10倍扩增缓冲液2.5μl;25mm mgcl2 1.5μl;10mm dntps 1μl;10μm引物11μl;10μm引物21μl；cdna产物2μl。95℃ 6min后，加0.4μl taqdna聚合酶（5u/μl）；95℃ 30s;55℃（crhr1α）/58℃（crhr2及gapdh）30s，72℃ 1min，30个循环后，72℃ 10min。

　　1.4.4  实时pcr定量分析  采用浓度逐渐递增的子宫肌层细胞cdna，作为相对已知浓度的cdna，在实时pcr中分别作为crhr1α和crhr2的标准品，同时扩增样本，应用rotorgene5软件绘制标准曲线，以该标准曲线相对定量样本cdna浓度，用crhr1α和crhr2与gapdh的相对cdna浓度比值反映crhr1α mrna和crhr2 mrna表达量。

　　1.5  统计学方法  所有数据均以中位数±四分位间距表示。以spss 10.0软件进行anova方法行两独立样本方差分析，以p＜0.05为差异具有统计学意义。

　　2  实验结果

　　2.1  子宫肌组织mrna甲醛变性凝胶电泳  见图1。

　　图1  子宫肌组织mrna甲醛变性凝胶电泳　略

　　2.2  子宫肌组织gapdh rt-pcr产物的琼脂凝胶电泳  见图2。

　　2.3  子宫肌组织crhr1 rt-pcr产物的琼脂凝胶电泳  见图3。

　　2.4  子宫下段肌组织crhr2 rt-pcr产物的琼脂凝胶电泳  见图4。

　　图2－图5  略

　　2.5  实时定量pcr结果  （1）未妊娠子宫肌中crhr1 mrna显著高于足月有宫缩、无宫缩子宫（p＜0.05）；足月妊娠有宫缩、无宫缩子宫肌中crhr1α mrna表达无明显差异（p＞0.05）（见图5）。（2）妊娠妇女子宫肌中crhr2 mrna水平较未妊娠时显著降低（p＜0.01）；足月有宫缩、无宫缩子宫肌中crhr2 mrna表达无明显差异（p＞0.05）（见图6）。

　　图6  略

　　3  讨论

　　随着分娩启动机制的研究进展，人类生殖系统中crh及其受体的研究越来越受到关注。crh受体（crhr）是一种g蛋白耦联受体。目前已知三种crh受体：crhr1（1αh）［3］和crhr2（2α，2β和2γ），2001年在二倍体catfish中发现了第三种crh受体（crhr3）［8］。在人类子宫肌层中发现有crh r1和r2受体。胎盘中表达crhr1，而不表达crhr2 mrna［7］。

　　既往人们发现妊娠子宫中存在crh受体1α、1β、2γ和变异的c［9］，非妊娠子宫中存在1α和1β［6］。子宫下段crhr1 mrna妊娠期下降，分娩时显著升高；宫底无变化。crhr1、crhr2蛋白定位于未妊娠及分娩子宫平滑肌上。妊娠子宫中，crhr定位于平滑肌及纤维原细胞中［5，7］。

　　在本研究中，与未妊娠子宫相比，足月妊娠无宫缩、有宫缩子宫肌中crhr1α mrna、crhr2 mrna显著降低（p<0.05），足月妊娠有宫缩与无宫缩子宫肌层crhr1α mrna、crhr2 mrna表达差异无显著性（p>0.05）。

　　妊娠期与非妊娠期子宫平滑肌crhr1α mrna与crhr2 mrna表达有显著差异，提示crhr1α mrna、crhr2 mrna与妊娠关系密切。妊娠期血浆crh的升高，正调节子宫肌组织中的crhr蛋白表达。crhr蛋白的表达增加抑制子宫肌中crhr mrna的表达。研究证明crhr mrna表达下降是由环磷酸腺苷-蛋白激酶a(cyclic adenosine monophosphate- protein kinase a, camp-pka)旁路介导的转录后途径如mrna降解引起的，与细胞外信号调节――丝裂原激活蛋白酶（mitogen-activated protein kinase, mapk）旁路无关［10］。有学者提出，crhr1对crh的亲和力比crhr2强，crhr2的配体是ucn，而不是crh，提示crhr2不直接调节分娩时母体血浆crh的变化［7］。总之，crhr1和crh、crhr2和ucn及它们与妊娠、分娩启动的联系及其作用机制尚待更深一步的研究。

　　【参考文献】

　　1  timothy w lovenberg, derek t chalmers, changlu liu, et al. crf2α and crf2β receptor mrnas are differentially distributed between the rat central nervous system and peripheral tissues. endocrinology,1995,136:4139-4142.

　　2  dimitris grammatopoulos, yalei dai, jing chen, et al. human corticotropinreleasing hormone receptor: differences in subtype expression between pregnant and nonpregnant myometrial. j clin endocrinol metab,1998,83:2539-2544.

　　3  warrick j inder, timothy cr prickett, m jane ellis, et al. the utility of plasma crh as a predictor of preterm delivery. j clin endocrinol metab,2001,86:5706-5710.

　　4  dimitris k grammatopoulos, edward w hillhouse. activation of pretein kinase c by oxytocin inhibits the biological activity of the human myometrial cortocotropinreleasing hormone receptor at term. endocrinology,1999,140:585-594.

　　5  grammatopoulos dk, hillhouse ew. basal and interleukin1 betastimulated prostaglandin production from cultrued human myometrial cells: differential regulation by corticotropinreleasing hormone. j clin endocrinol metab,1999,84:2204-2211.

　　6  alexander pisarchik, andrzej t slominski. alternative splicing of crhr1 receptors in human and mouse skin: identification of new variants and their differential expression. faseb j，2001，15:2754-2756.

　　7  e karteris, d grammatopoulos, y dai, et al. the human placenta and fetal membranes express the corticotropinreleasing hormone receptor 1α(crh1α) and the crhc variant receptor. j clin endocrinol metab,1998,83:1376-1379.

　　8  e w hillhouse, h randeva, g ladds, et al. corticotropinreleasing hormone receptors. biochemical society transactions,2002,30:428-432.