【摘要】 目的：探讨毒死蜱对大鼠睾丸生精细胞增殖及相关因素的影响。方法：sd大鼠30只随机分为3组，对照组、低剂量0.8mg/(kg·d)和高剂量8.0mg/(kg·d)染毒组，28d后观察大鼠体质量、睾丸脏器系数变化，采用免疫组化sp法检测睾丸生精细胞中增殖细胞核抗原(pcna)的表达。结果：低、高剂量染毒组体质量分别为(278.86±20.47)、(244.80±21.18)g，低于阴性对照组，差异有统计学意义(p<0.05);生精细胞pcna增殖指数pi分别为(22.66±2.59)%、(14.26±2.31)%，均低于阴性对照组，差异有统计学意义(p<0.05)。结论：毒死蜱可降低生殖细胞pcna的表达，对雄性生殖系统造成损害。
【关键词】 毒死蜱;生精细胞;增殖细胞核抗原
毒死蜱(chlorpyrifos，cpf)是一种杀虫谱广、低毒高效的有机磷农药，其全球销售额占有机磷农药第一位。近年来有机磷农药对环境和机体的危害日益引起人们的重视。美国国家癌症研究机构2004年报道cpf与肺癌的发生有关[1]。同时cpf作为一种可疑的环境内分泌干扰物，其内分泌干扰作用问题令人们十分关注。国内有研究表明cpf可以引起大鼠精子数目减少，精子活动度下降，精子畸形率增加等生精功能障碍[2]，但其确切的分子机制尚不明确。本实验通过研究一定剂量的cpf对大鼠生殖细胞中增殖细胞核抗原(pcna)表达的影响，以探讨cpf对生精功能的影响，为进一步阐明cpf的雄性生殖毒性的可能机制提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物分组及染毒方法 30d龄健康雄性sd大鼠30只，体质量55～65g，长江大学医学院动物中心提供。
1.1.2 试剂 毒死蜱原药(纯度99%，湖北沙隆达股份有限公司产品);溶剂为市售精制玉米油;pcna免疫组化试剂盒(北京中心生物技术有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 动物分组及染毒方法 霍恩氏法确定cpf对sd大鼠的ld50值。将大鼠随机平均分为3组，分别为(溶剂)对照组、cpf低浓度0.8mg/(kg·d)组、cpf高浓度8mg/(kg·d)组。所有动物均以玉米油作为溶剂，腹腔注射染毒，自由饮食，饲料中不含豆饼，染毒28d(2个生精周期)后处死。
1.2.2 检测指标 ①大鼠体质量、睾丸称重并计算脏器系数。处死大鼠后剖腹暴露睾丸，分离系膜及周围脂肪，切除睾丸，立即称湿重并计算脏器系数。公式：脏器系数(%)=脏器湿重(g)/体质量(g)×100%。②称重后取大鼠一侧睾丸，常规方法固定、包埋、切片、脱蜡，3%的h2o2室温孵育15min，pbs清洗后热修复10min。正常山羊血清封闭，室温孵育10min，滴加1∶150稀释的pcna单克隆抗体，4℃过夜。pbs清洗，滴加生物素标记的二抗孵育10min，辣根酶标记的链霉卵白素37℃孵育15min。pbs清洗，dab显色，苏木精复染，透明，封片。阴性对照用pbs代替一抗。
1.3 统计学处理 每个睾丸组织随机选择10个垂直切面的生精小管，以细胞核内出现明显的棕黄色颗粒为阳性细胞，分别计数pcna表达阳性生精细胞数各占总生精细胞数的比例，即增殖指数(pi)。采用spss10.0软件进行方差分析。p<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 染毒对大鼠体质量、睾丸重量及其脏器系数的影响 见表1。结果显示染毒组的大鼠体质量增长缓慢，染毒组的睾丸脏器系数与对照组相比较有统计学差异(p<0.05)，脏器系数呈上升趋势。
2.2 染毒对大鼠pcna表达的影响 见表2。结果显示各组大鼠均可见pcna阳性表达的生精细胞，主要见于精原细胞和精母细胞，圆形精子细胞少量表达，精子不表达。各染毒组生精细胞pi与对照组比较有统计学差异(p<0.05)，且pi值呈下降趋势。表1 各组大鼠体重、睾丸重量及其脏器系数的比较表2 各组大鼠生精细胞pcna增殖指数的比较
3 讨 论
睾丸正常生精过程即从精原细胞到精子形成的连续增殖分化过程，包括精原干细胞的增殖分化、精母细胞的减数分裂和精子形成三个阶段。在此过程中，精子发生对外来有害因素的作用非常敏感，环境化学物可在不同阶段干扰精子的正常发生。本实验结果显示随cpf染毒剂量的增加，大鼠体质量增长减慢，且睾丸脏器系数与对照组比较显著升高，这与国内学者研究结果基本一致[2]。表明cpf对雄性生殖器官具有一定毒性作用，可能影响睾丸的正常精子发生过程。
pcna基因表达是细胞dna复制、细胞增殖的一个标志。pcna作为dna聚合酶δ的辅助蛋白，具有协同dna前导链和后随链的合成，为dna复制起始所必须，具有维持dna多聚酶活性的作用。pcna含量变化在细胞增殖中有明显周期性，与dna合成密切相关[3]。本实验观察到pcna在生精细胞核内表达，且主要见于精原细胞和精母细胞，而精子不表达。这是由于处于有丝分裂期的精原细胞和减数分裂期的精母细胞中有dna合成，而精子已停止细胞分裂，无明显dna合成。本研究结果显示cpf染毒时生精细胞的pcna表达减弱，且随染毒浓度加大，pi值显著减低。
cpf对生殖细胞增殖能力的影响可能是一个多途径、多因素的过程。本实验研究结果表明cpf对雄性生殖器官产生毒性作用，可能是通过一定途径影响pcna的表达，使生精细胞多聚酶活力下降，生殖细胞增殖能力下降，干扰精子的正常生长和发育过程，其具体分子机制还需进一步研究。
【参考文献】
[1]lavanja mcr， dosemeci m， samanic c， et al.pesticides and lung cancer risk in the agricultural health study cohort[j]. am j epidemiol， 2004， 160(9)：876885.
[2]文一，魏帅，潘家荣. 毒死蜱对雄性大鼠生精功能的影响[j]. 农药，2008，47(8)：595597.
[3]chieffi p， nastic m，fulgione d， et al. expression of pcna in the testis of lizard，podarcis sicula:an endogenous molecular marker of mitotic germinal epithelium proliferation[j]. zygote，2001，9：317320.
