【摘要】 目的 研究溃疡性结肠炎（uc）患者外周血cd4+cd25+调节性t细胞数量、相关细胞因子的水平以及foxp3基因的表达，分析它们在uc发病机制中的作用。方法 收集uc患者及健康对照组外周抗凝静脉血，分离纯化t淋巴细胞。pe标记的抗cd4单抗，fitc标记的抗cd25单抗，作双色流式细胞术，分析uc患者外周血cd4+cd25+调节性t细胞百分率，elisa法检测血清中相关细胞因子il10、tgfβ1的水平，rtpcr检测t细胞foxp3 mrna的表达。 结果 与正常对照组相比，uc患者外周血cd4+t、cd25+t细胞百分率作及cd4+cd25+t/cd4+t均显著下降（p均<0.05），细胞因子il10、tgfβ1的水平也显著降低（p<0.05），t细胞foxp3 mrna的表达也明显降低（p<0.05）。结论 uc患者外周血存在细胞免疫功能失调，cd4+cd25+调节性t细胞数量与功能状态发生改变，t细胞耐受机制的破坏可能与uc的疾病活动状态和发病机制有关、
【关键词】 溃疡性结肠炎，调节性t细胞，白细胞介素10、转化生长因子β1，foxp3基因
study on the regulatory t cell and the expression of foxp3 gene in patients with ulcerative colitis
chen zhengwei,chen ting, zhou xuemin
（department of medicie,the first affiliated hospital of xianning college,xianning hubei 437100，china）
abstract:objective to investigate the quantity of peripheral blood cd4+cd25+ regulatory t cell, related cytokines and the expression of foxp3 gene in ulcerative colitis(uc)patients, and to analyze the role of them in the pathogenesis of uc. methods anticoagulated venous blood by heparin was collected from uc patients and healthy people. t cells were collected by human cd3+ t cell enrichment column. the quantity of peripheral blood cd4+cd25+ regulatory t cell was detected by immunofluorescence staining and bicolor flow cytometry by cd25/cd4 gating. the levels of related cytokines il10、tgfβ1 were assayed by elisa, the expressions of foxp3 mrna on t cell were analyzed by rtpcr. results compared with healthy people, in uc patients, the expression of cd4+cd25+t cell and the level of foxp3 mrna both decrease significantly (p<0.05). the levels of related cytokines il10、tgfβ1 were lower than those of control group.conclusion there is peripheral blood celluar immunological function disorder in uc patients, and the abnormal expression of cd4+cd25+t cell ,the related cytokines and foxp3 mrna on t cell may involve in uc immunopathogenesis.
key words：ulcerative colitis;regulatory t cell; il10;tgfβ1;foxp3 mrna
溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，uc）是一种主要累及直肠、结肠黏膜的慢性非特异性炎症性疾病,以腹痛、腹泻、黏液血便、里急后重为主要临床特征，病程迁延不逾，长达数年甚至几十年。uc的发病率在国内外都有上升的趋势，但因发病机制尚不清楚，还难以找到真正特异而有效的治疗方法[1]。大量资料证明它是在遗传、环境、感染等因素的影响下出现的细胞免疫功能失调所致。cd4+cd25+调节性t细胞在免疫性疾病中的作用逐渐成为研究的热点，但到目前为止关于该细胞在uc患者体内的研究资料较少。因此，研究cd4+cd25+调节性t细胞在uc患者外周血中数量和功能的变化,将为uc的发病机制以及从免疫调节的角度治疗uc提供新的思路，同时也为我们进一步研究开发cd4+cd25+调节性t细胞疫苗奠定理论基础。
1 资料与方法
1.1 一般资料
30例uc患者为我科2006年住院病例，男22例，女8例，年龄28～65岁，中位年龄42岁，均符合uc的诊断标准[2]；对照组30例来自同期本院体检中心,为健康人群，排除uc及其它自身免疫性疾病，其中男20例，女10例，年龄25～60岁，中位年龄38岁。
1.2 主要试剂和仪器
epicsxl型流式细胞仪（beckman公司），9600型基因扩增仪（pe公司），h cd3+ t cell enrichment column、淋巴细胞分离液（axisshield公司），anticd4pe、anticd25fitc（eb公司），msigg1fitc、msigg1pe（miltenyibiotec公司），小牛血清、溶血素（0.85%nh4cl溶液），il10与tgfβ1 elisa诊断试剂盒（北京中杉），rtpcr试剂盒（上海生工），rna提取试剂盒（上海宝生物）。
1.3 方法
1.3.1 外周血t细胞的分离
无菌采集患者及对照组外周静脉血4ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离得单个核细胞。无菌玻璃培养皿37℃培养30min，去除粘附于玻璃培养皿的单核细胞，以获取悬浮的淋巴细胞。加入0.85%nh4cl溶液溶解红细胞，经t细胞分离富聚柱（h cd3+ t cell enrichment column），采用负筛选法获得纯化的t淋巴细胞。用20%的小牛血清rpmi1640培养液调整细胞浓度约2×106/ml。fcm法检测其纯度大于96%，台盼蓝拒染法检测其活性大于98%。
1.3.2 外周血cd4+cd25+调节性t细胞的检测
病例组与对照组分别取2 支试管，各加入100μl t细胞悬液，每组2管分别加入小鼠抗人单克隆igg1pe和小鼠抗人单克隆igg1fitc（阴性对照管）、抗cd4pe和抗cd25fitc各种标记抗体均20μl。混匀，4℃避光30min，pbs洗涤2次，各管加入0.5ml缓冲液，上流式细胞仪检测,另外每次实验做一管空白对照。
1.3.3 外周血标本血清中il10、tgfβ1的检测
收集患者及健康对照组的血标本，肝素抗凝自然沉降后，取上清置于-80℃的低温冰箱内保存，然后运用elisa法检测血清中il10、tgfβ1的水平，具体操作按说明书进行。
1.3.4 外周血t细胞foxp3 mrna的检测
rtpcr测定foxp3 mrna的表达水平。取离心后收集的细胞,用trizol试剂常规提取淋巴细胞总rna, foxp3 mrna特异引物做rtpcr反应,扩增片段为226bp,扩增目的基因在琼脂糖凝胶上电泳，上游引物：5'tcacctacgccacgctcat5',下游引物：5'actcagggttgtggcggatgg3',在紫外分析仪上观察结果，分析rtpcr产物的相对含量。设βactin作为内参照，上游引物：5'cctcgcctttgccgatcc3',下游引物：5'ggatcttcatgaggtagtcagtc3',扩增片段为448bp,以比值foxp3/βactin作为半定量。
1.4 统计学分析
所有检测结果以±s表示，两两比较采用t检验，两变量相关性采用直线相关分析，均经sas8.1统计软件处理,p<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 cd4+t、cd25+t、cd4+cd25+t细胞的检测
uc患者外周血cd4+t、cd25+t和cd4+cd25+t细胞百分率均明显下降，与对照组比较差异有统计学意义（p<0.05,表1）。
表1 uc病例组与对照组外周血t细胞亚群比较（略）
与对照组比较，*p<0.05
图1 病例组与对照组外周血cd4+cd25+t细胞流式细胞检测图（略）
(a:同型对照; b:正常对照; c:病例组)
2.2 外周血相关细胞因子的检测
uc患者外周血清中il10、tgfβ1的含量分别为28.5±13.7、171.0±91.6，明显低于对照组的42.1±14.6、256.8±120.4，差异均有统计学意义（p均<0.05)。
2.3 外周血t细胞foxp3 mrna的表达
uc患者外周血t细胞foxp3/βactin比值为0.36±0.07，对照组为0.75±0.12，uc病例组foxp3 mrna的表达均明显下降，与对照组比较差异有统计学意义（p<0.05，图1）。
图1 两组外周血t细胞foxp3 mrna电泳图（略）
(1:病例组； 2:对照组； m:marker)
3 讨论
uc是由多种因素影响导致的免疫功能失调的慢性非特异性免疫病，目前病因尚未完全清楚。cd4+cd25+调节性t细胞是近年来研究发现的具有独特免疫调节作用的一种专职抑制细胞, 该细胞在经tcr介导的信号刺激活化后不仅能抑制cd4+和cd8+t细胞的活化和增殖,还能抑制其免疫功能,且这种免疫抑制性不具有mhc限制性，能够抑制同种同型或同种异型t细胞的增殖。这种功能使cd4+cd25+调节性t细胞成为维持机体免疫耐受的重要调控者。它对机体中自身反应性t细胞和部分效应性t细胞的选择性抑制是免疫自稳形成和维持的重要机制之一，其正常水平和功能有助于免疫系统对自身抗原的刺激建立良好的耐受状态，避免自身免疫病的发生。
目前国内外研究提示，cd4+cd25+调节性t细胞的数量减少或功能异常有可能导致多种自身免疫病的发生。sugiyama 等[3]研究表明银屑病患者cd4+cd25+调节性t细胞功能异常、免疫失调，使体内致病性t细胞大量增殖。sarween等[4]研究发现cd4+cd25+调节性t细胞不仅抑制致病性cd4+t细胞增殖,也能抑制其组织浸润。我们发现uc患者外周血cd4+t、cd25+t、cd4+cd25+调节性t细胞数量明显低于对照组，这可能与uc患者细胞免疫功能失调有关。而uc患者体液免疫功能增强，b细胞活化产生大量的自身抗体，这可能是cd4+cd25+调节性t细胞数量与比例减少，不能正常抑制b细胞的功能。因此提升调节性t细胞的疫苗将有助于uc的临床治疗。我们还发现uc患者外周血中il10、tgfβ1的含量也降低。cd4+cd25+调节性t细胞活化后主要通过细胞接触依赖机制或抑制性细胞因子依赖机制主动发挥免疫抑制作用，它可分泌大量的il10、tgfβ1等抑制性细胞因子，用相应抗体中和此类细胞因子则其体内免疫抑制作用降低，说明cd4+cd25+调节性t细胞的功能可以通过这些抑制性细胞因子来实现[5]。这些细胞因子具有抑制抗原呈递细胞及拮抗效应性t细胞的功能，在cd4+cd25+调节性t细胞介导的免疫耐受及cd4+cd25+调节性t细胞的产生和增殖中发挥着重要作用[6，7]。有研究认为在细胞因子机制中,以通过分泌il10 的方式对效应性t细胞抑制作用更明显[8]。因此我们推测可能由于uc患者外周血中cd4+cd25+调节性t细胞数量的减少，导致自身反应性t细胞激活增多，同时cd4+cd25+调节性t细胞减少，产生抑制性细胞因子的水平降低，抑制能力下降，导致激活的自身反应性t淋巴细胞增多，细胞免疫功能失调。
转录因子foxp3可特异表达于胸腺和外周淋巴组织中天然的cd4+cd25+调节性t细胞亚群上，可以认为foxp3是调节cd4+cd25+调节性t细胞发育的一个重要开关。hori等[9]已经证实逆转录foxp3可转化初始型t细胞，使其成为具有调节功能的cd4+cd25+调节性t细胞。foxp3作为cd4+cd25+调节性t细胞一个相对特异的标志,它的表达是该细胞发挥功能的前提。机体正常状态下存在的自身反应性t细胞之所以对自身抗原不发生反应,重要的一个方面就cd4+cd25+调节性t细胞的存在抑制了它的活化；另一方面,walker等[10]研究表明cd4+cd25+t细胞的活化可导致cd4+cd25+调节性t细胞表达foxp3增加,并与抑制活性有关。huan等[11]研究发现ms患者外周血cd4+cd25+t细胞foxp3信号传导和蛋白表达异常,foxp3水平的降低表明cd4+cd25+调节性t细胞免疫调节功能受损。jaecke等[12]用foxp3转导扩增的cd4+cd25+调节性t细胞改善了1型糖尿病的病情。我们也发现uc患者外周血foxp3基因的表达也明显低于对照组，这说明uc患者体内cd4+cd25+调节性t细胞的免疫抑制功能可能下降，细胞免疫失调，体液免疫的耐受机制被打破，导致患者体内产生多种自身抗体。
因此，通过上调cd4+cd25+调节性t细胞数量，诱导il10、tgfβ1等相关细胞因子以及foxp3基因的表达，将为治疗uc提供一个新途径。故进一步研究调节性t细胞及foxp3基因在uc发病机制中的作用，将为该病的临床治疗提供重要的理论依据。
【参考文献】
[1]kornbluth a,sachar db.ulcerative colitis practice guidelines in adults american college of gastroenterology,practice parameters committee[j].am j gastroenterol,1997,92:204.
[2]叶任高，陆再英.内科学[m].第5版.北京：人民卫生出版社，2001:428
[3]sugiyama h,gyulai r,toichi e,et al.dysfunctional blood and target tissue cd4+cd25+ high regulatory t cells in psoriasis: mechanism underlying unrestrained pathogenic effector t cell proliferation[j].j immunol,2005,174(1):164
[4]sarween n,chodos a,raykundalia c,et al.cd4+cd25+ cells controlling a pathogenic cd4+ response inhibit cytokine differentiation,cxcr3 expression and tissue invasion[j].j immunol,2004,173(5):2942
[5]maloy kj,salaun l,cahill r,et al.cd4+cd25+t(r) cells suppress innate immune pathology through cytokinedependent mechanisms[j].j exp med,2003,197:111
[6]masaki h,cherry ik,masanori n,et al.il10 is required for regulatory t cells to mediate tolerance to alloantigen in vivo[j].j immunol，2001,166 (9):378
[7]yamagiwa s,gray j,hashimoto s,et al.a role for tgfβin the generation and expansion of cd4+cd25+ regulatory t cells from human peripheral blood[j].j immunol,2001,166 (12):728
[8] fengning zhan,wu hongfei,wu jun,et al.immunology mechanism of cd4+ cd25+ t regulatory cells acting on effect or t cells[j].journal of nanjing medical university,2004,18(4):178
[9]hori s,nomura t,sakaguchi s.control of regulatory t cell development by the transcription factor foxp3[j]. science,2003,299(5):1057
