作者：朱月蓉， 邱红， 刘军权， 陈复兴
【摘要】 目的： 观察茶多酚对人γδt细胞杀伤肿瘤细胞活性的影响和诱导人结肠癌细胞株（sw480）凋亡和死亡的作用。方法： 在体外用不同浓度的茶多酚诱导人γδt细胞和sw480细胞株，然后测定人γδt细胞杀瘤活性和对肿瘤细胞的作用。用不同浓度的茶多酚分别诱导sw480细胞4 h后，弃含有茶多酚的培养液再继续培养24 h，然后测定其死亡和凋亡数，用γδt细胞作对照组。结果： 茶多酚浓度350 mg/l，作用γδt细胞4 h后能明显增强γδt细胞的杀伤肿瘤细胞活性，与未诱导组和其他浓度组相比，p<0.01；γδt细胞对经茶多酚处理后的sw480细胞杀伤活性也明显高于对照组（p<0.01）。各种浓度的茶多酚分别与γδt和sw480细胞作用4 h，弃诱导液再继续培养24 h后，均能诱导其死亡和凋亡，在茶多酚浓度350 mg/l、诱导时间4 h时最明显；同一浓度的茶多酚诱导sw480细胞死亡和凋亡率明显高于γδt细胞组。结论： 茶多酚在一定浓度时能明显提高γδt细胞对肿瘤的杀伤活性；经茶多酚处理的sw480细胞更易被γδt细胞杀伤。茶多酚浓度在350 mg/l时能诱导sw480细胞凋亡而对人γδt细胞无影响。
【关键词】 茶多酚； γδ淋巴细胞； sw480细胞株； 抗肿瘤活性； 凋亡
［abstract］ objective: to observe cytotoxicity of γδt cell induced by tea polyphenols and the direct effects of tea polyphenols on human tumor cells sw480 cell strain death and apoptosis.methods： γδt cells and sw480 cell strain were induced by tea polyphenols in vitro to examine cytotoxic activity of γδt cell and its direct effects on tumor cells. sw480 was induced by tea polyphenols continuously for 4 hours following being cultured without tea polyphenols for 24 hours, then the rate of death and apoptosis of sw480 were measured. γδt cell was used as control group. results： cytotoxicity of γδt cell induced by tea polyphenols with concentration of 350 mg/l was significantly higher than that of control group and other groups(p<0.01). cytotoxicity of γδt cell on sw480 induced by tea polyphenols was higher than the control group(p<0.01).after being induced by tea polyphenols continuously for 1～8 hours following cultured without tea polyphenols for 24 hours, sw480 showed significant cell death and apoptosis in different concentration comparing with the control group. tea polyphenols did not display significant effects on γδt cell. conclusion： tea polyphenols can significantly enhance cytotoxicity of γδt cell and the sw480 induced by tea polyphenols was easily killed by γδt cell. tea polyphnols in certain concentration can induce cell death and apoptosis of sw480, while it appears no cytotoxicity to γδt cell.
［key words］ tea polyphenols； γδt cell； sw480；antitumor activity；apoptosis
茶是备受人们喜爱的饮品之一，而在茶叶中最具有药效作用的成分为茶多酚类物质。众多的体内外研究及动物实验证明，茶多酚有多种生物活性，其防癌抗癌、抗突变、抗氧化、抗衰老、抗菌等作用已有许多研究报道，在诱导肿瘤细胞凋亡中也具有重要意义［1-3］。γδt细胞是体内的固有免疫t细胞，它广泛分布于消化系统和呼吸系统上皮组织内；γδt细胞除了有与αβt细胞类似的一些功能特征外，识别抗原不需要mhc分子提呈，直接识别蛋白质和肽类抗原以及非肽类抗原，有抗原提呈作用，能通过细胞接触和分泌的细胞因子起免疫调节作用［4］。γδt细胞和茶多酚均具有抗消化道肿瘤作用，为了解两者有无相关性，我们用茶多酚诱导人γδt细胞和人结肠癌细胞株，观察在体外用不同浓度的茶多酚经不同时间诱导的sw480细胞死亡和凋亡情况，并观察γδt细胞对sw480杀伤活性的作用，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 材 料
茶多酚，从市售龙井茶中制备，茶多酚纯度为77.0％； sw480细胞株（上海细胞生物研究所）；胰蛋白酶、rpmi1640（gibco公司产品）；人ab血清（徐州市血站）；胎牛血清和淋巴细胞分离液（中国科学院血液病研究所）；异戊烯焦磷酸、四甲基偶唑蓝(mtt)(isopentenylpgrophosphate，ipp)、二甲亚砜(dms0)（sigma公司）；il2（厦门特宝生物公司）；抗人tcrγδfitc购自杭州联科生物（immunotech, france）；seac全自动酶免系列分析仪(北京希亚克技术有限公司)；流式细胞仪(美国bd公司的facscaliar)，分析软件为cellquest，每个标本分析细胞数≥1×104。
1.2 方 法
1.2.1 γδt细胞的培养和鉴定 按文献［5］方法取健康献血者末梢抗凝血10 ml,加入淋巴细胞分离液上，以2 000 r/min离心15 min，吸取单个核细胞层，用生理盐水洗涤3遍（1 500 r/min离心，10 min/次），加入含10%小牛血清、5%人ab血清和ipp 3 mg/l的rpmi1640培养液中，调整细胞数为1×108/l，置75 cm2细胞培养瓶中，于37℃,50 ml/l co2培养箱中培养，根据细胞生长情况及时添加培养液。收集培养10 d的细胞进行细胞表面标志检测和其他试验。
1.2.2 茶多酚对sw480和γδt细胞生长的影响 取培养10 d的γδt细胞和对数生长期sw480细胞以每孔5×104个细胞分别接种于96孔板，用茶多酚(终浓度分别为100,200,400,800,1 600和3 200 mg/l)诱导，每组设5个复孔，细胞经茶多酚诱导4 h后弃诱导液加入含10%小牛血清的rpmi 1640，继续培养24 h后加入mtt（5 mg/ml）20 μl/孔，继续培养4 h，弃上清，加入dmso 150 μl/孔。混匀后在全自动酶标阅读仪上测各孔d值，根据测定数换算成抑制率。
1.2.3 γδt细胞和sw480细胞凋亡检测 取培养10 d的γδt细胞和对数生长期sw480细胞以每孔2×105个细胞接种于6孔板，用茶多酚(终浓度分别为100,200,400,800,1 600和3 200 mg/l)诱导，每组设3个复孔。细胞经茶多酚诱导4 h后弃诱导液继续培养24 h，弃上清，sw480细胞用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞，γδt细胞直接收集，用rpmi 1640培养液洗涤3遍，加入70%冷乙醇固定，4℃过夜。pbs洗涤3次，加入pi染液(生理盐水 129.6 ml，pi 10 mg，rna酶2 mg，tritonx100 1 ml，枸橼酸钠200 mg，加双蒸水至200 ml)，4℃避光染色30 min，用fcm检测，记录激发波长488 nm处的红色荧光。
1.2.4 γδt细胞杀伤活性检测 取培养10 d的γδt细胞和对数生长期sw480细胞均配成2×108/l，加入6孔细胞培养板中，每孔3 ml，培养24 h后加入不同浓度的茶多酚，同时设未加药的对照组，继续孵育24 h后，sw480细胞用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞和直接收集γδt细胞，用rpmi1640培养液洗涤3遍，将靶细胞sw480细胞配成2×108/l，效应细胞γδt细胞配成2×109/l的悬液，用本室建立的乳酸脱氢酶释放法［6］测定γδt细胞杀伤活性，将效靶细胞数按10∶1比例混合，以500 r/ min离心5 min，置37℃,50 ml /l co2培养箱中孵育6 h后，轻轻混匀细胞，再以1 500 r/min离心10 min。收集上清液在全自动生化分析仪（olympus au1000）340 nm波长下测定光密度值d）。
杀伤活性=实验组d值-效应细胞自然释放组d值靶细胞最大释放组d值-靶细胞自然释放组d值×100%
1.3 统计学处理
采用stata8.0软件，数据以±s表示，用χ2检验比较γδt细胞和sw480细胞凋亡率有无统计学意义。
2 结果
2.1 γδt细胞形态学观察和纯度鉴定
pbmc在γδt细胞培养基中培养24 h即可见贴壁生长，48 h后集落开始变大，培养10 d可见大的集落和单个贴壁生长细胞，单个细胞可见细胞呈条梭状，也有小量呈浮悬生长细胞。收集培养前后细胞进行mab荧光标记后经流式细胞术检测并分析结果。见图1，培养前γδt细胞数为4.21%；培养10 d时γδt细胞数为70.35%。
图1 pbmc 培养前后γδt细胞百分率表达（略）
fig 1 percentage of γδt cell and expression before and after cultured by pbmc
2.2 不同浓度茶多酚诱导后的γδt细胞和sw480细胞凋亡率
结果显示，经茶多酚诱导4 h弃诱导液继续培养24 h后，茶多酚浓度在350 mg/l时引起γδt细胞凋亡率为7.88%，显著低于sw480细胞（24.76%），见图2。其他浓度均有明显差异（表1）。
图2 茶多酚在350 mg/l时诱导的γδt细胞和sw480细胞株凋亡率（略）
fig 2 figure of apoptosis of γδt cell and sw480 cell lines which were induced by tea polyphenols(350 mg/l)
表1 不同浓度的茶多酚对γδt细胞和sw480细胞凋亡的影响（略）
tab 1 effect of various concentration tea polyphenols on the apoptosis of γδt cell and sw480
a：与同一药物浓度作用的γδt细胞比较， p<0.05；b：与同一细胞的对照组比较， p<0.05
2.3 茶多酚对γδt细胞和sw480细胞株杀伤活性的影响
在实验中发现经茶多酚作用4 h时γδt细胞杀伤活性最高，因此本实验选择该时间为作用时间。γδt细胞经茶多酚(350 mg/l)作用后，杀伤sw480细胞活性显著高于其他浓度组，与对照组和其他浓度组相比较，p<0.01。结果见图3。
图3 茶多酚对γδt细胞杀伤活性的影响（略）
fig 3 effect of cyctotoxic activity of γδt cell
2.4 茶多酚对γδt细胞和sw480细胞的抑制率
见图4。茶多酚浓度在400 mg/l之内对两者均没有明显的影响，随着浓度升高γδt细胞组死亡率显著高于sw480组，p<0.01，而sw480变化不明显。
图4 不同浓度茶多酚对γδt细胞和sw480的抑制率（略）
fig 4 effect of various concentration tea polyphenols on the inhibitory tatio of γδt cell and sw480
3 讨论
茶多酚是茶叶中的主要成分，约占茶叶干重30％，具有防癌和诱导肿瘤细胞凋亡作用。但其诱导不同的肿瘤细胞凋亡结果却不相同，可能与其调控某些肿瘤细胞的致癌基因／抑癌基因的表达以及其他机理有关，如对cfos和cmyc基因的调控上的差异，致使其对癌细胞生长抑制和诱导凋亡上有所不同。其防癌作用主要是通过抗氧化和消除自由基，抑制亚硝基形成反应，调节致癌原代谢酶等［4］。直接抗癌作用的研究近年来也有重大进展，许多体外试验表明，茶多酚能抑制多种肿瘤细胞包括肺癌、肾癌、结肠癌、乳腺癌、上皮细胞癌和黑色素瘤等的生长［7-9］，甚至直接杀伤这些肿瘤细胞。
自1990年从肺癌肿瘤浸润淋巴细胞（tils）中分离出γδτ细胞，并发现这些细胞对新鲜的自体肿瘤细胞和k562细胞有高效杀伤活性以来，许多研究证实了在直肠癌、肾癌、肝癌、胃癌和乳腺癌等实体瘤的til中存在有γδτs细胞，并具有抗肿瘤作用［10-13］。
γδτ细胞杀伤肿瘤细胞的机制与ctl细胞和nk细胞相似，主要通过穿孔素、颗粒酶和fas/fasl途径起作用。然而γδτ细胞对肿瘤细胞的识别方式还不完全清楚，通常γδτ细胞对肿瘤细胞的识别大多数是mhc非限制性的，主要是通过nkg2d识别肿瘤细胞表达的mica,micb,ulbpi3,mhcⅰb类蛋白和f1atp合酶等配体。corvaisier等［14］研究也证实，对肿瘤细胞的识别还与肿瘤细胞上γδtcr刺激物（如甲羟戊酸途径代谢物ipp）产生和icam1表达密切相关。我们的实验也表明，从人外周血分离培养出的γδτ细胞对消化道系统常见肿瘤细胞均有较强的杀伤作用。zheng等［15］给已建立的鼻咽癌裸鼠注射正常人γδτ细胞两次，每次5×107，可见肿瘤明显缩小和生存期延长，且与注射次数相关，免疫组化结果证实肿瘤内有局部坏死，注射的γδτ细胞在瘤内聚积。戴梦华等［16］用人胰腺癌外周血经抗人tcrγδτ单抗包被扩增的γδτ细胞注入已建立胰腺癌的裸鼠腹腔内，发现γδτ细胞具有显著的抑瘤作用。朱忆期等［17］用自身外周血培养的γδτ细胞治疗4例胃癌术后患者，随访10～25个月未见复发。γδτ细胞体内应用除直接杀伤肿瘤细胞外，还可以通过与nk细胞和dc相互作用以及释放出抗肿瘤免疫中的关键分子ifnγ来启动抗肿瘤免疫细胞网络来实现持续的抗肿瘤免疫应答［18,19］。为了解茶多酚与人γδt细胞的关系，我们应用茶多酚诱导人γδt细胞和sw480细胞株，发现经诱导的γδt细胞对肿瘤细胞的杀伤活性明显增高，含量在350 mg/l时增高最为显著，与对照组和其他浓度组比较均有显著性差异，当茶多酚浓度＜50 mg/l和＞500 mg/l时作用明显降低。这一结果说明茶多酚对人γδt细胞的用量有一个最适浓度或“浓度窗”(concentration window)现象，这一点在设计实验和临床应用时要加以注意。
本组实验结果提示，茶多酚在一定浓度和条件下能诱导sw480细胞死亡和凋亡。我们用各种浓度的茶多酚在持续作用sw480细胞实验中，作用时间达48 h，茶多酚的浓度增加至3 200 mg/l时均不能明显诱导出sw480细胞死亡和凋亡，此时对照组（γδt细胞）死亡率明显增加；而作用1～8 h后再继续培养24 h即能明显致sw480细胞死亡和凋亡。可能原因是，茶多酚影响了肿瘤细胞的生长周期，使肿瘤细胞生长阻滞在g0／g1［20］，当除去诱导剂后，细胞开始增殖，受损的细胞逐渐死亡。另外，由于茶多酚中混有多种成分，可能有的成分能诱导sw480细胞死亡或有凋亡的信号，而有的成分能阻断其作用，待将茶多酚成分洗弃后，这些死亡或凋亡信号继续作用而致细胞死亡和凋亡。因此要搞清其机理，有必要筛选出茶多酚粗提物中的确切有效成分。
以上结果表明，茶多酚可以诱导sw480细胞死亡和凋亡,茶多酚持续作用不如短时作用后弃诱导液继续培养24 h对sw480细胞致死和凋亡作用明显。γδt细胞经茶多酚作用4 h后能明显提高其对sw480细胞的杀伤活性，提示茶多酚对消化系统大量存在的γδt细胞杀伤肿瘤细胞功能有增强作用。然而茶多酚诱导肿瘤细胞死亡、凋亡和提高γδt细胞杀伤性机理仍不十分清楚。是否与其抑制sw480细胞多聚酶作用［21］和诱导其凋亡有关还是其他因素致使γδt细胞对sw480细胞杀伤易感性增加所致仍有待研究。因此，开展这方面研究对茶多酚药用价值的开发和临床应用具有重要意义。
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