【摘要】  目的： 检测活动期皮肌炎(dermatomyositis，dm)患者外周血cd4+t细胞中转化生长因子β1（transforming growth factor�拨�1，tgf�拨�1）以及血清磷酸肌酸激酶（ck）含量。初步探讨cd4+t细胞tgf�拨�1在皮肌炎发病机制中的作用。方法： 收集12例活动期皮肌炎患者和12例健康对照者外周血，采用免疫磁珠分离法获得cd4+t细胞，通过rt�瞤cr方法检测出各组tgf�拨�1表达水平。观察cd4+t细胞中tgf�拨�1表达与ck含量的相关性。结果： 活动期皮肌炎患者外周血cd4+t细胞中tgf�拨�1相对表达量为0.751±0.107，显著高于健康对照0.438±0.170﹙p<0.05﹚。cd4+t细胞tgf�拨�1表达量与ck含量呈中度正相关﹙r=0.67, p<0.05﹚。结论： 活动性皮肌炎患者外周血cd4+t细胞中tgf�拨�1 mrna表达显著升高，可能与皮肌炎疾病发生有关。

【关键词】  皮肌炎 cd4 t细胞 �拨�1

    ［abstract］  objective: to investigate the expression of trans�瞗orming growth factor�拨�1 (tgf�拨�1)mrna in cd4+ t cells of peripheral blood from the dermatomyositis (dm)patients in active stage, and explore the association with serum creatinkinase levels. methods： cd4+t cells from peripheral blood were isolated by microbeads，and tgf�拨�1 mrna was measured by reverse transcriptase polymerase chain reaction (rt�瞤cr).  results： the expression of tgf�拨�1 was significantly higher in cd4+ t cells from the dermatomyositis  patients than those from healthy control group (0.751±0.107 vs 0.438±0.170，p<0.05﹚. there was positive correlation between the expression levels of tgf�拨�1 mrna and serum creatinkinase levels（r=0.67，p<0.05﹚. conclusion： tgf�拨�1 was significantly higher in cd4+ t cells of peripheral blood from the dermatomyositis patients. tgf�拨�1 may play a role in the damage of dm.

    ［key words］  dermatomyositis；cd4+ t cells；tgf�拨�1

    皮肌炎(dermatomyositis，dm)是一组亚急性或慢性起病、免疫介导的自身免疫性疾病, 主要表现为对称性的肢体近端无力、肌肉疼痛、肌酶明显升高，同时伴有以眶周为中心的紫红色水肿性斑、gottron氏征等特征性皮肤损害。组织病理学特点为肌组织内炎细胞浸润与肌纤维坏死［1］。其病因及发病机制目前尚不完全清楚, 但近年来在皮肌炎患者受累皮肤和肌肉活检中发现大量活化的cd4+t细胞浸润，cd4+/cd8+比值为2.5［2］。转化生长因子β1（transforming growth factor�拨�1，tgf�拨�1）是人体多种组织细胞的生长调控因子，对细胞外间质表达、基质降解、细胞增殖分化和细胞凋亡功能等有明确的作用。并且，tgf�拨�1还具有较强的免疫调节作用。本研究通过检测皮肌炎患者外周血cd4+t细胞tgf�拨�1 mrna的表达，同时与患者血清ck含量进行相关性分析,探讨其在皮肌炎发病机制中的作用。

    1  对象与方法

    1.1  研究对象　

    12例活动期皮肌炎患者选自2007年6月～2008年2月江苏大学附属医院风湿科、皮肤科门诊及住院患者，其中男5例，女7例，年龄40～65岁，平均51.6岁。病程2个月～3年，平均2.15年。诊断依据为1975年bohan的诊断标准［3］,剔除合并肿瘤及重叠综合征患者。以临床表现、补体降低、肌酶、血沉升高以及肌电图改变综合判断疾病的活动性。检测前,患者至少3个月内未接受糖皮质激素、免疫抑制剂或具有免疫调节作用的药物治疗。选用单位体检正常者为健康对照组，其中男5例，女7例，年龄41～66岁，平均51.2岁。

    1.2  主要试剂与仪器 

    trizol试剂(invitrogen公司)；反转录试剂盒(toyobo公司)；水平电泳槽(bio�瞨ad公司)；凝胶电泳图像分析仪(syngene公司)；免疫磁珠(miltenyi公司)。

    1.3  细胞分离 

    收集患者和健康对照者静脉血10 ml，肝素抗凝，通过淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，再采用免疫磁珠分离出cd4+t细胞，细胞纯度大于92%。

    1.4  rt�瞤cr

    按常规方法提取总rna，严格按照反转录试剂盒说明书将总rna反转录为cdna后-20℃贮存备用。根据基因库中公布的基因序列，通过primer premier 5.0 软件设计pcr特异性引物，聚合酶链反应引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列为：β�瞐ctin上游引物5′�瞔acgaaactaccttcaactcc3′，下游引物5′�瞔atactcctgcttgctgatc3′，扩增产物262 bp；tgf�拨�1上游引物5′�瞘ctcctgtgacagcagggat3′，下游引物5′ �瞘gcagaagttggcatggtag3′，扩增产物303 bp。pcr扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃（β�瞐ctin）或54℃（ tgf�拨�1 ）退火，72℃ 45 s，共30个循环，72℃延伸7 min。

    1.5  pcr产物分析及半定量计算

    pcr扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，计算cd4+t细胞tgf�拨�1和β�瞐ctin条带密度比值（tgf�拨�1/β�瞐ctin）作为tgf�拨�1的相对表达强度。

    1.6  统计学分析

    所有数据采用spss11.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，以p<0.05 为差异有统计学意义。两变量的相关程度采用直线相关分析法。

    2  结  果

    2.1  活动性皮肌炎患者cd4+t细胞tgf�拨�1 mrna表达水平检测结果

    健康对照（n=12）和皮肌炎患者（n=12）cd4+t细胞tgf�拨�1的相对表达强度分别为0.438±0.170和0.751±0.107，经检验t=5.38，p<0.01。见图1。

    2.2  活动期皮肌炎患者cd4+t细胞tgf�拨�1 mrna表达水平与血清ck含量相关性分析 

    活动期皮肌炎患者cd4+t细胞与血清ck含量的相关系数为r=0.67，p<0.05，呈中度正相关。见图2。

    3  讨  论

    研究认为皮肌炎是由于日光辐射、微生物感染、外伤等诱因致使易感人群发生自身免疫紊乱并导致皮肤、横纹肌为主等器官损伤的一种结缔组织疾病。皮肌炎患者肌内膜及其血管周围存在大量以活化的cd4+t淋巴细胞为主，部分b细胞以及巨噬细胞参与的单个核细胞群的浸润［4］。近来研究发现皮损组织中th淋巴细胞介导的炎症，微血管损害和角质形成细胞的凋亡失调是疾病发生的重要机制。

    tgf�拨�1是一类具有双向调节功能的生长因子，主要由活化的t细胞、b细胞和巨噬细胞合成和分泌，某些肿瘤细胞、成骨细胞以及内皮细胞也可产生，tgf�拨�1能趋化巨噬细胞和成纤维细胞，促进血管生成，从而在创伤修复中起重要作用。tgf�拨�1也具有促进和抑制免疫的双向调节功能。根据不同的表达量发挥不同的效应。对tgf�拨�1基因敲除小鼠的研究发现［5］，肌肉组织中tgf�拨�1在正常表达情况下具有抗炎作用。然而当tgf�拨�1过度表达时，促进炎症发生并可导致肌内膜纤维化。此作用可能与tgf�拨�1刺激自身肌肉组织结缔组织生长因子的表达有关。ctgf能促进成纤维细胞增殖迁移, 细胞外基质形成［6］。在duchenne 肌营养不良病中发现肌组织中tgf�拨�1 mrna表达明显增高。amemiya等［7］对5例皮肌炎患者采用大剂量静脉滴注免疫球蛋白治疗，对治疗前后患者肌活检比较后发现，临床症状和组织学改善的同时tgf�拨�1表达也显著下降。

    本次实验结果显示，皮肌炎患者cd4+t细胞tgf�拨�1表达明显高于健康对照组。皮肌炎患者血清ck均值为（2503.42±1344.05）u/l，较正常值（0～200 u/l）显著增高，与tgf�拨�1表达呈中度正相关。提示tgf�拨�1可能是导致皮肌炎肌肉损害的原因之一。患者中有5例伴有肺间质病变，肺纤维化，1例伴甲状腺瘤，1例伴甲状腺功能减退；5例肺间质病变、肺纤维化患者tgf�拨�1表达尤为增高，均高于0.80；可能与tgf�拨�1具促进成纤维细胞增殖致纤维化有关。此外，tgf�拨�1还对早期肿瘤有抑制作用，进展期促进肿瘤浸润、转移［8］。皮肌炎患者特别是部分老年患者常伴随肿瘤的发生。本次实验中并未发现伴有肿瘤的患者，可能与所选病例病程较短以及样本数量少、患者以中年为主有关。要进一步了解tgf�拨�1在皮肌炎发病机制中的作用还需要增加病例作进一步研究。

【参考文献】
  ［1］ 史玉泉, 周孝达, 吕传真. 实用神经病学［m］.3 版.上海: 上海科学技术出版社, 2004：1271-1273.

［2］ caproni m, torchia d，cardinali c，et al.infiltrating cells,related cytokines and chemokine receptors in lesional skin of patients with dermatomyositis［j］. br j dermatol，2004,151(4):784-791.

［3］ smits hh, de jong ec, schuitemaker jh, et al. intercellular adhesion molecule��1/lfa��1 ligation favors human th1 development ［j］. j immunol，2002 ,168(4):1710-1716.

［4］ grundtman c, malmstrom v, lundberg ie. immune mechanisms in the pathogenesis of idiopathic inflammatory myopathies［j］. arthritis res ther，2007,9(2): 208.

［5］ amemiya k,semino�瞞ora c,granger r,et al.development of inflammatory myopathy in tgf�拨�1 knockout mice: characterization of the disease and attenuation after treatment with fibronectin peptides［j］. neurology，1999,52(s2)：a448.

［6］ maeda n, kanda f, okuda s, et al. transforming growth factor�瞓eta enhances connective tissue growth factorexpression in l6 rat skeletal myotubes［j］. neuromuscul disord，2005，15(11)：790-793.

［7］ amemiya k, semino�瞞ora c, granger rp, et al.downregulation of tgf�瞓eta1 mrna and protein in the muscles of patients with inflammatory myopathies after treatment with high�瞕ose intravenous inmmunoglobulin［j］.clin immunol ,2000 ,94(2):99-104.

［8］ 俞清翔.转化生长因子β与肿瘤转移的研究进展［j］.世界华人消化杂志，2006，14（25）:2538-2541.