作者：古衍 ，姚吉龙，姜向坤，张春晖，凌奕
【摘要】 目的：探讨男性不育患者精液血小板活化因子(paf)、血小板活化因子乙酰水解酶(pafah)活性的变化,以及外周血中单个核细胞(pbmc) paf 受体(pafr) 的表达。方法:对10例男性不育患者(其中5例为精液异常组，5例为不明原因不育组)采用生物法检测精液中paf含量,酶水解底物显色法测定pafah 活性,流式细胞仪检测pbmc上pafr 的表达。并与5例有正常生育功能的男性健康体检者对照。结果:精液异常组paf含量(1.87 ±0.76)μg/l ,pafah活性(23.56±6.86)μmol/(min·l) 、pbmc 上pafr 的表达与健康体检者比较差异有非常显著性意义(p<0. 01);不明原因不育组paf含量(2.12 ±0.81)μg/l ,pafah活性(21.65±5.13)μmol/(min·l) 、pbmc 上pafr 的表达与健康体检者比较差异也有非常显著性意义(p<0.01);精液异常组与不明原因不育组相比差异无显著性。结论:男性不育患者精浆paf降低、pafah升高，paf、pafah、pafr 三者在男性不育的发生中可能起重要作用。
【关键词】 不育，男(雄)性;精液;血小板;血小板活化因子;乙酰水解酶;血小板活化因子受体
[abstract] objective: to study the concentration of plateletactivating factor( paf) and the activation of pafacetylhydrolase(pafah) in sema of infertile man as well as the expression of pafreceptor (pafr)in peripheral blood pbmc of these men. methods: ten men with infertility(five men with abnormal semen and five men with unexplained infertility) and five men with normal fertility ability were enrolled in this study. the levels of paf in semen were determined by the washed platelet aggregation test (bioassay) and the activity of pafah was determined by the changes of substrate assay. the expression of pafr on pbmc was examined by cytoflowmetry. results: the results showed that the concentration of paf and the activity of pafah in the group with abnormal semen are significantly lower than that in control group [(1.87 ±0.76)μg /l vs (8. 47 ±1. 52)μg /l , p<0. 01] . the concentration of paf and the activation of pafah in the group with unexplained infertility are also significantly lower than that in control group. furthermore, the expression of pafr on pbmc induced markedly in peripheral blood of men with infertility (p<0.01). but comparing the paf levels ,the activity of pafah and the expression of pafr on pbmc in the men with abnormal semen and the men with unexplained infertility, there was no significant difference. conclusion: in the men with infertility, paf levels in semen and the expression of pafr on pbmc are obviously reduced, while the activity of pafah is markedly increased. the changes of paf and pafah and the expression of pafr in pbmc are related to the male infertility.
[key words] male， infertility; semen; platelet; plateletactivating factor; acetylhydrolase; plateletactivating factor receptor
据不完全统计，在我国约10对夫妇中有1对存在不同程度的生育障碍，由男性因素及不明原因不孕导致的生育障碍约占30%。精子功能在男性生育中占据重要地位。大量的内源性因子可以调节精子生育的潜能，其中血小板活化因子( platelet activating factor, paf)是目前研究较活跃的细胞因子之一，本实验主要探讨男性不育患者精液paf的变化及外周血单个核细胞paf受体的表达, 旨在为男性不育患者的辅助诊断及新的防治措施研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 研究对象
2006年10月～2007年12月在深圳市妇幼保健院及深圳流花医院不孕不育门诊就诊的男性不育患者10例(精液异常5例，不明原因不育5例)，不育年限3～10年，年龄24～40岁。5例有正常生育功能的健康自愿者5例，年龄28～39岁。3组在年龄上的差异无统计学意义，且均无合并症。
1.2 实验方法
1.2.1 试剂与仪器 paf 标准品(sigma 公司产品)，pafah 检测试剂盒和鼠抗人pafr igg(cay2man 产品，晶美生物公司代理)，fitc 标记的兔抗鼠igg,流式细胞仪(bd) 等。
1.2.2 paf 测定 受试者禁欲3～5 d，在室验室以手淫法取精液，按文献[1,2]经双层纱布过滤后，取精液1 ml，加无水吡啶和醋酐各10 μl，加入4 ml甲醇中，旋涡混合，离心后吸取上清液加入氯仿和双蒸水1 ml，用生物法检测paf含量。
1.2.3 血浆pafah 活性检测 取精浆2 ml，浓缩为0. 5 ml，按试剂盒操作,酶标仪读取不同时间的a 值，用pafah 标准品对照，计算出各样本pafah 的活性。
1.2.4 外周血pbmc 上pafr 的表达 采静脉血1 ml，分离出pbmc，取1 ×105 细胞悬液，加鼠抗人pafr单抗40 μl，fitc 标记的兔抗小鼠单抗40 μl，对照管加fitc 标记的正常兔igg 40 μl ,混匀后置4 ℃ 3 min ，pbs 洗3 次,弃上清液，加固定液0. 5 ml ，尼龙网过滤后用流式细胞仪分析。
1.3 统计学处理
实验数据用spss 10. 0 软件包进行处理，结果以(±s) 表示，数据统计用单因素方差分析和直线相关分析。
2 结果
2.1 3组精液paf 含量及pafah 活性比较
精液异常组及不明原因不育组精液paf含量显著低于健康对照组，差异有统计学意义(p<0.01)，但精液异常组精液paf含量与不明原因不育组相比，差异无显著性(p=0.72);精液异常组及不明原因不育组精液pafah活性显著高于健康对照组，差异均有统计学意义(p<0.01)，但精液异常组精液pafah活性与不明原因不育组相比，差异无显著性(p=0.86);paf下降与pafah上升平行相关。见表1。表1 3组精液paf 含量及pafah活性的比较
2.2 3组外周血pbmc中pafr阳性细胞比例及表达
精液异常组及不明原因不育组外周血pbmc中pafr阳性细胞比例显著低于健康对照组，差异有统计学意义(p<0.01)，但精液异常组精液外周血pbmc中pafr阳性细胞比例与不明原因不育组相比，差异无显著性(p=0.83)。见表2。表2 3组外周血pbmc中pafr阳性细胞比例及表达
3 讨论
paf 是迄今发现的最强的血小板聚集剂，在体内有着类似于激素的广泛生物学活性。paf 与不孕不育密切相关，已证实男性不育患者精液paf降低。本研究亦显示精液异常和不明原因不育患者的精液paf较有正常生育能力者的低。近年来又有学者发现，冻融的公猪精子经外源性paf处理后能立即提高精子活力[3]。paf在男性不育中的作用机制可能为：包含钙网织蛋白的小囊泡和1, 4, 52三磷酸肌醇受体最集中于发生顶体反应的人精子顶体赤道部和尾部颈段，这些ca2 + 储藏所是精子获能和发生顶体反应(ar)过程中使ca2 +进入的关键调节器[4]。颈段是近端中心粒的位置，paf可能对中心粒完整的精子有刺激影响，而精子尾部中段既是线粒体场所也是精子活动的关键部位。胞内ca2 + 浓度增加是诱导精子获能和ar 的必需条件。paf是通过受体介导调控胞内ca2 + 浓度影响精子活力和受精潜力，提高成功受精率及胚胎发育率。paf对精子功能的影响是受体介导的，属于ip3、dag、ca2 +的信使系统[5]，继之激活蛋白激酶c ，催化靶蛋白磷酸化而发挥生物学效应[6]。但是，本研究显示精液常规检查正常的不明原因不育患者的精浆paf亦较有正常生育功能的低，其具体原因有待进一步研究。
paf在不育患者精液中降低并维持机制复杂，在实验中发现患者精液中pafah活性显著升高，精液常规检查正常的不明原因不育患者pafah也显著升高，其机制不清。paf 变化的疾病中大多伴pafah 的改变，其是疾病的诱发因素还是疾病的结果，或是对身体的一种保护性反应现尚未明了。乙酰水解酶是paf的主要降解酶并在其代谢调节中起关键作用。有研究发现精浆pafah活性与精子活力存在明显负相关[7,8 ] 。在正常获能过程中去除pafah可促使paf合成，从而提高精子活力,促进精卵结合和受精。
pafr 广泛存在于血小板、中性粒细胞、t 淋巴细胞及肺组织等[4]，人类精子pafr 的cdna 与人类白细胞pafr几乎完全一样。在实验中发现精液异常或不明原因不育患者pbmc 中pafr 阳性细胞比例及表达数目均显著降低。有学者发现,小鼠精子敲除pafr后，由于其不能表达受体而获能率明显降低(p<0.01) ，体外受精率(21. 5%)亦低于野生型精子( 66. 7%)[6]。
总之，本研究显示，精液异常及不明原因不育的男性患者精液paf较有正常生育能力者显著下降。然而，paf活性对精子的确切机制仍未清楚，对生殖领域而言，仍有必要对精液中paf浓度和精子结合paf的能力进行深入的研究。此外，paf活性在精子和生育力的生殖意义，包括精子与受体有关的信号转导，及paf在妊娠过程中的确切作用，仍需进一步研究。
【参考文献】
1 muirhead e.antihypertensive functions of the kidney [j] . hypertension dallas, 1980,10(2):444464.
2 benveniste m, tence p, varenne j, et al. semisynthese or structure purposee dufacteur activant less plaquettes: pafacther, unalkyl ether analogue de la lysophosphosphatidylcholine[j] .cracad sci paris，1979,18(9):10371040.
3 bathgate r, maxwellwm, evans g. effects of plateletactivating factor and plateletactivating factor: acetylhydrolase on in vitro postthaw boar sperm parameters [j]. theriogenology, 2007,67:886892.
4 roudebush we, purnell et. plateletactivating factor content in human sperm and pregnancy outcome [j]. fertil steril, 2000, 74(2):257260.
5 roudebush we, massey jb, elsner cw, et al. the significance of plateletactivating factor and fertility in the male primate: a review [j]. j med primatol, 2005, 34 (1): 2024.
6 purnell et, roudebushwe, sengstacke fd, et al. plateletactivating factor stimulates intracellular calcium levels in exposed sperm [j]. fertil steril, 2001, 76 (3): s57.
7 wu c, stojanov t, chami o, et al. evidence for the autocrine induction of capacitation of mammalian spermatozoa [j]. biol chem, 2001, 276 (29):2696226968.
8 zhu j, brackett nl, aballa tc, et al. high seminal p lateletactivating factor acetylhydrolase activity in men with spinal cord injury [j]. j androl, 2006, 27 (3): 429433.
9 zhu j, massey jb, mitchell2leefd, et al. plateletactivating factor acetylhydrolase activity affects sperm motility and serves as a decapacitation factor [j]. fertil steril, 2006, 85(2):391394.
