作者：李晓峰，董艳玲，郭远瑾，容琼文，李燕华，李吕力
【摘要】 目的：探讨血红素氧合酶1在lps诱导急性炎症中的表达及臭苜蓿根提取物的干预作用。方法：通过脂多糖(lps)干预raw264.7 细胞系建立炎症细胞模型。实时荧光定量rtpcr法检测血红素氧合酶1(ho1)的基因表达差异，western blot法测定ho1的蛋白表达量。结果：臭苜蓿根提取物明显升高巨噬细胞ho1的mrna表达水平，western blot结果显示，臭苜蓿根提取物干预后ho1的蛋白表达水平也明显升高。结论：臭苜蓿根提取物能提高巨噬细胞ho1基因的表达，促进ho1的释放而发挥一定的抗炎作用。
【关键词】 臭苜蓿根提取物;炎症;巨噬细胞;血红素氧合酶1
[abstract] objective: to study the express of ho1 on acute inflammation induced by lps and the antiinflammatory effect of the melilotus suaveolens extract. methods: inflammatory cell model was constructed by lps acting raw264.7 cell line. the expression of mrna and protein of hemeoxygenase 1(ho1) were detected by realtime pcr and western blot method. results: the expression of ho1 mrna in macrophage cell was significantly enhanced by the melilotus suaveolens extract. the result of western blot showed that the expression of ho1 protein was significantly increased after the intervention of melilotus suaveolens extract. conclusion: the melilotus suaveolens extract can resist inflammation by enhancing the expression of ho1.
[key words] melilotus suaveolens extracts; inflammation; macrophage cell; ho1
ho1(hemeoxygenase1)是胆红素形成过程中的限速酶之一，亦称热应激蛋白32(hsp32),为可诱导型ho，分子量为32 kd,主要分布于单核巨噬细胞系统的微粒体中，在脑、脊髓、心、肝、脾、肺、胰、肠、皮肤、血管平滑肌以及内皮细胞中均有表达，在脾脏中活性最高[1]。ho1可在缺氧、缺血等多种应激状态下表达[2]。臭苜蓿根，豆科(leguminosae)草木犀属(melilotus suaveolens) 1年生或2年生草本植物，是临床用于抗炎的一种中草药。臭苜蓿根产生抗炎作用的分子生物学机制还不明确。本实验拟通过lps刺激raw 264.7小鼠巨噬细胞系建立炎症细胞模型[3]，采用实时荧光定量rtpcr法﹑western blot法观察ho1在巨噬细胞中的表达以及臭苜蓿根提取物在炎症中的作用。
1 材料和方法
1.1 实验材料与仪器
rpmi1640、trizol 购自gibico公司;lps(escherichia coli o111:b4)和mtt购自sigma公司;ho1羊抗鼠多克隆抗体购自r&d systems公司;mmlv逆转录酶、dntp购自promega公司;sybr green 购自biotium公司;oligo(dt18)及引物由invitrogen公司合成。小鼠巨噬细胞系raw 264.7 为同济医学院冻存。
1.2 实验方法
1.2.1 臭苜蓿根提取物的制备 取50 g风干的臭苜蓿根磨成粉末，用700 ml/l乙醇于85 ℃提取3次(1次500 ml,每次 1.5 h)，真空过滤浓缩提取液，用去离子水稀释至1 g/ml(药材：水)浓度。取5 ml浓缩液至100 ml的分液漏斗中，连续石油醚提取直至其干重达0.425 g。用rpmi1640培养基将其稀释成3种浓度10 mg/l、5 mg/l和1 mg/l备用。
1.2.2 细胞培养 小鼠巨噬细胞系raw264.7使用rpmi1640培养液(加入100 u/ml青霉素，100 mg/l链霉素和100 ml/l胎牛血清)，50 ml/lco2培养箱中37 ℃培养。
1.2.3 细胞模型的建立和干涉 lps处理前24 h将细胞接种于6、24或96孔板上，24 h后细胞贴壁后弃上清，加入含lps10 g/l的培养液和不同浓度的提取物，作用不同时间后收集细胞，分别使用实时荧光定量rtpcr法、western blot法检测。
1.2.4 实验分组 实验共分4组。(1)阳性对照组：地塞米松(dm) 0.5 g/l作阳性对照;(2)阴性对照组：黄芪多糖(aps)100 mg/l作为阴性对照;(3)空白对照组：只用10 g/l的lps处理而不加药物干预;(4)正常对照组：不用lps处理也不加药物干预。
1.2.5 药物细胞毒性的检测 mtt法，在终止细胞培养前4 h加入20 l mtt溶液(浓度5 g/l，ph7.4)，终止细胞培养后每孔加入150 μl dmso， spectramax 250全自动定量绘图酶标仪测定a490值。细胞病变效应(cytopathic effect，cpe)检测，细胞在提取液中培养24 h后在显微镜下观察细胞形态以检测细胞病变。
1.2.6 血红素加氧酶1(ho1)mrna水平的检测 实时荧光定量rtpcr法检测ho1的基因表达。细胞干预18 h后提取rna检测ho1的基因表达量。细胞总rna提取采用trizol试剂提取法，具体方法参照说明书。将总rna保存在-80 ℃备用。rtpcr在abi prime 7700 sequence detection system进行。引物序列：musho1:forward: 5'cacagatggcgtcacttcgtc3', reverse: 5'gtgaggacccactggaggag3', musβactin: forward: 5' gctacagcttcaccaccacag 3', reverse: 5' ggtctttacggatgtcaacgtc 3'。rna经逆转录反应合成cdna, rt及pcr反应体系按试剂盒说明书进行(常规pcr以逆转录产物为模板，实时荧光定量rtpcr以常规pcr扩增产物稀释后为模板)。实验结果采用abi prime 7700 sequence detection system自带软件对数据自动分析后, 用所给ct值应用公式folds = 2δδct 进行基因表达差异分析[4]。
1.2.7 ho1蛋白水平的检测 western blot法检测细胞中药物干预前、后ho1的蛋白表达量的变化。细胞干预24 h后，冷pbs洗涤，加入细胞裂解液，冰上孵育15 min，使用细胞刮刮下并收集裂解液，10 000 rpm 4 ℃离心10 min，取上清保存于-20 ℃冰箱。用bca法测定蛋白质浓度, 取相同量蛋白质用于100 g/l sds聚丙烯酰胺凝胶电泳;转移至硝基纤维素膜，50 g/l脱脂奶粉溶液37 ℃封闭1 h;加入羊抗鼠ho1多克隆抗体(1∶200)，4 ℃孵育过夜，洗膜;应用辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶200)室温孵育1 h，再加入化学发光显色剂显色, x光片曝光显影, 凝胶成像分析系统扫描，pro3.0软件半定量分析。
1.3 统计学处理
应用spss12.0统计分析软件包，采取单因素方差分析对实验数据进行处理，以p<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 药物对细胞的毒性
mtt实验结果显示，3种浓度(10 mg/l、5 mg/l和1 mg/l)药物干预细胞24 h后对细胞活性没有明显影响。cpe结果亦如此(图1、2)。
2.2 药物干预前、后ho1的mrna水平
药物提取物干预后ho1水平明显升高，并且药物浓度越高，ho1水平越高，呈现一个剂量依赖型关系(图3)。
2.3 药物干预前、后ho1的蛋白水平
western blot结果显示，药物干预后ho1的蛋白水平明显升高(图4)，之间的差异有统计学意义(p<0.01)。
3 讨论
巨噬细胞在炎症的启动过程中起着非常关键的作用，它通过激活机体的免疫系统，释放细胞因子、有生物活性的脂类介质及活性氧等一系列炎症介质参与炎症反应[5]。根据其对炎症反应的促进或抑制效应的不同，这些炎症介质大致上可分为两类：促炎介质和抗炎介质,两者的比例关系及动态变化是决定炎症转归的关键因素[6]。当细胞面临有毒性的化学物质或病原体侵袭的时候，机体的免疫系统会释放出ho1。炎症反应过程中，在炎症介质产生的同时抗炎因子ho1也被分泌和活化, ho1的过表达可直接或间接地抑制炎症连锁反应。ho1是催化血红素降解的限速酶，从而生成胆绿素、游离铁和co。研究表明，它们不仅能清除机体的活性氧，还能抑制多种促炎介质的产生，促进多种抗炎介质的表达，并且拮抗一些炎症介质的细胞毒效应[7,8]。
臭苜蓿根提取物能通过抑制促炎介质和细胞因子tnfα、il1、il6、no的产生发挥抗炎作用。同时，臭苜蓿根提取物也对抗炎介质产生一定的影响。本实验结果显示，臭苜蓿根提取物能促进ho1的表达和释放，且该作用呈剂量依赖性。以上结果表明，臭苜蓿根提取物能通过促进ho1的基因表达和释放从而发挥抗炎作用。本实验选用地塞米松和黄芪多糖分别作为阳性和阴性对照。地塞米松是传统的抗炎药物;黄芪多糖是临床上用于增强免疫的免疫调节剂，能够增强促炎因子的释放[9]。
本研究从分子水平探讨了臭苜蓿根提取物的体外抗炎活性及其可能的分子机制。通过本实验发现，臭苜蓿根提取物能抑制促炎症介质的表达，并促进抗炎介质的表达，从而产生广泛的抗炎作用。
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