作者：郭峻莉，郑少江，郑少萍，罗志飞
【摘要】 目的：利用antigen43(ag43)/成纤维细胞生长因子ⅰ型受体(fgfr1)重组嵌合蛋白作为疫苗，了解其是否具有抑制小鼠肿瘤生长的作用，并初步探讨其作用机理。方法：40只balb/c雌性小鼠接种meth a细胞后第7天，随机分为ag43/fgfr1蛋白免疫组(af组)、ag43蛋白免疫组(ag43组)、fgfr1蛋白免疫组(fgfr1组)和生理盐水对照组(ns组)4组，每组10只，观察免疫治疗后的荷瘤小鼠肿瘤体积和生存曲线，分别用免疫组织化学方法检测肿瘤组织微血管密度(mvd)，免疫印迹(western blot)方法检测抗自身fgfr1的抗体，酶联免疫斑点试验(elispot)检测分泌抗自身fgfr1抗体的b淋巴细胞的数量。结果：ag43/fgfr1组与fgfr1蛋白、ag43蛋白、生理盐水对照组肿瘤组织mvd计数分别为11.9 ± 2.3、59.6 ± 3.8、60.6 ± 1.2和61.9± 3.4 (p<0.01);与对照组相比，ag43/fgfr1组肿瘤体积明显变小(p<0.01)，存活时间明显延长(p<0.01)，血清中发现含有抗自身fgfr1的抗体且发现小鼠脾脏中分泌抗自身fgfr1抗体的b淋巴细胞数目明显增多(p﹤0.01)。结论：ag43/fgfr1蛋白质疫苗能够诱导荷瘤鼠产生特异性免疫反应，从而抑制肿瘤血管生成和肿瘤的生长。
【关键词】 成纤维细胞生长因子i型受体;ag43 基因;蛋白质疫苗;肿瘤血管生成
[abstract] objective: to explore the antitumor effect of immunotherapy with a recombinant ag43/fgfr1 chimeric protein vaccine in a mouse meth a fibrosarcoma model. tumor volume and survival rate of the mice were observed in 3day intervals. methods: microvessel density (mvd) was detected by immunohistochemistry. autoantibodies against selffgfr1 were detected by western blot. the antifgfr1 antibodyproducing b cells (apbcs) were detected by enzymelinked immunospot (elispot) assay. results: mvd was significantly lower in ag43/fgfr1immunized group than in ag43immunized group、fgfr1immunized group and ns group (11.9 ± 2.3 versus 59.6 ± 3.8 versus 60.6 ± 1.2 and 61.9± 3.4, p﹤0.01). the tumor volume was significantly smaller in ag43/fgfr1immunized group than in the control groups (p﹤0.01), and the survival time was significantly longer in ag43/fgfr1immunized group than in the control groups (p﹤0.01). antibodies against selffgfr1 were identified in ag43/fgfr1immunized group. compared with the three control groups, the numbers of apbcs in ag43/fgfr1immunized group were significantly increased(p﹤0.01). conclusion: these results demonstrated that the ag43/fgfr1 protein vaccine could induce the production of antitumor autoimmunity, which further inhibit angiogenesis and growth of solid tumor.
[key words] fibroblast growth factor receptor1; antigen 43; protein vaccine; tumor angiogenesis
成纤维细胞生长因子ⅰ型受体(fgfr1)是一种跨膜蛋白质，作为配体结合区的胞外段和配体碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)结合后发生二聚体化导致自身磷酸化，从而诱导肿瘤血管生成，进而促使肿瘤生长和转移[1，2]。研究表明，bfgf/fgfr1传导通路在肿瘤新生血管的生成过程中起重要作用[35]。可见，封闭fgfr1胞外段就可以阻断bfgf的信号传导路径，阻止肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤的生长。然而，fgfr1是一个自身分子，免疫系统会对其产生免疫耐受。因此，需要寻找一种诱导产生抗自身fgfr1免疫反应的合理策略。
antigen43(ag43)是大肠杆菌表达的一种表面抗原蛋白分子，在一个大肠杆菌表面可表达5万多个ag43 分子[6]。目前研究证实ag43具有十分强大的免疫原性，如果将外源抗原蛋白在ag43α结构域的148个氨基酸处插入，构成ag43的嵌合分子，能促使免疫系统产生对嵌合的外源蛋白的免疫反应，产生外源蛋白特异的抗体[7]。我们前期研究表明，以fgfr1为分子靶标的主动免疫治疗可以有效抑制肿瘤血管生成，进而抑制肿瘤的生长[8,9]。本研究利用重组的ag43/fgfr1嵌合蛋白质作为疫苗，在小鼠纤维肉瘤肿瘤模型中进行实验，了解该疫苗是否具有抑制小鼠肿瘤血管生成的作用，进而达到治疗肿瘤的目的。
1 材料与方法
1.1 材料
3种重组蛋白质ag43/fgfr1、ag43和fgfr1已由笔者构建质粒并在大肠埃希菌中表达和提取纯化获得。雌性6～8周龄balb/c小鼠购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，小鼠纤维肉瘤细胞株meth a由海南省热带病重点实验室提供并保种于含10 % fcs 的rpmi1640培养液中。rpmi1640培养基和胎牛血清(fcs)购自美国gibico brl公司，免疫组化试剂盒(vestastain abc kit)和dab显色试剂盒购自vector laboratories公司。兔抗鼠fgfr1抗体和生物素化二抗购自santa cruz 公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠或小鼠igg均购自santa cruz 公司，大鼠抗小鼠cd31(pecam1)单克隆抗体购自bd pharmingen 公司。pvdfbottomed 96孔板购自millipore公司,明矾佐剂购自imject alum公司。
1.2 方法
1.2.1 动物模型和免疫方法 免疫前称取上述重组蛋白质冻干粉剂溶解于无菌生理盐水中，并与灭菌氢氧化铝佐剂(终浓度为4 mg/ml)混匀在室温下放置30 min 后备用。取40只6～8周龄balb/c雌性小鼠，先于右腋部皮下接种2×106个meth a细胞，接种后第7天，随机分为ag43/fgfr1蛋白免疫组(af组)、ag43蛋白免疫组(ag43组)、fgfr1蛋白免疫组(fgfr1组)和生理盐水对照组(ns组)4组，每组10只。每组小鼠每次分别皮下注射10 μg(100 μl)ag43/fgfr1、10 μg(100 μl)ag43、10 μg(100 μl)fgfr1和100 μl ns，每周1次，连续4周。每3 天 观察小鼠生存状况并测量肿瘤大小1次，肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积(mm3)= (0.5×长×宽×高) 。免疫后采集小鼠血清做免疫学检测。
1.2.2 免疫印迹(western blot)分析 重组蛋白质用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将分离的蛋白质转移到pvdf膜上，分别用各实验组小鼠第4次免疫后血清(1∶200)或兔抗鼠fgfr1抗体(1∶500)作为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠igg或者山羊抗兔igg为二抗，按文献[8]的方法进行western blot 分析。
1.2.3 酶联免疫吸附试验(elisa)和酶联免疫斑点试验(elispot) 分别用上述重组蛋白作为抗原，按常规包被过夜后，分别以第4次免疫后各组小鼠的血清作为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠igg亚型、iga、igm为二抗，具体操作步骤参照文献[8]。
1.2.4 免疫组织化学染色 实验结束后处死各组小鼠，取新鲜肿瘤组织进行冰冻切片，用大鼠抗小鼠cd31单克隆抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠igg为二抗，abc免疫组化法检测肿瘤微血管密度(mvd)，具体操作步骤参照文献[9，10]。
1.3 统计学处理
实验数据用±s表示，生存曲线按 kaplanmeier 方法进行绘制，应用spss12.0软件进行统计分析，组间比较采用t 检验和 anova 检验，p﹤0.05 为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 ag43/fgfr1蛋白免疫治疗抑制小鼠肿瘤的生长
af组小鼠的肿瘤生长受到明显的抑制(图1a)，肿瘤体积明显小于其它3个组(p﹤0.01)。从各组荷瘤小鼠的生长曲线(图1b)也发现，af组荷瘤小鼠存活时间明显长于其它3个组，组间差异有统计学意义(p﹤0.01)。
2.2 ag43/fgfr1蛋白免疫治疗抑制肿瘤血管生成
小鼠肿瘤组织冰冻切片做cd31免疫组化染色观察，结果显示af组(图2a)肿瘤组织内微血管密度(mvd)明显低于fgfr1组(图2b)、ag43组(图2c)和ns组(图2d)。随机计数10个高倍视野，af组、fgfr1组、ag43组、ns组每个高倍镜视野肿瘤组织mvd分别为11.9 ± 2.3、59.6 ± 3.8、60.6 ± 1.2和61.9± 3.4 (p﹤0.01)。
图2 肿瘤组织内微血管密度的免疫组化观察郭峻莉等.ag43/fgfr1嵌合蛋白疫苗抗小鼠纤维肉瘤血管生成的实验研究 2.3 ag43/fgfr1蛋白免疫诱导产生特异性免疫反应
western blot检测结果显示，af组免疫小鼠的血清能够特异性识别分子量约为48 kda 左右的蛋白质条带(图3a)，与重组的ag43/fgfr1蛋白产物大小一致，而其它对照组血清均无识别(图3b、c和d)。进一步用elispot检测，发现af组免疫小鼠脾脏中分泌特异性抗小鼠fgfr1抗体的b淋巴细胞数目明显增多(图3e)，与其它对照组比较差异有统计学意义(p﹤0.01)。
3 讨论
现已证实实体肿瘤的生长与转移是依赖于血管生成的。研究表明，bfgf/fgfr1传导通路在肿瘤新生血管的生成过程中起重要作用，在不同的动物模型中干扰或阻断bfgf/fgfr1信号环路可以有效抑制肿瘤血管生成，进而达到治疗肿瘤的目的[35]。但是，fgfr1作为一个自身分子，如果以其作为疫苗免疫宿主，宿主免疫系统就会对自身抗原分子产生免疫耐受。kugler等[11]将自身分子(肿瘤)抗原体外和树突状细胞(dc)共同培养，制成dc疫苗诱导肿瘤抗原产生免疫反应;vernersson等[12]研究表明，自身ige fc段确实含有b细胞表位，b细胞可以识别并能够引起体液免疫反应产生相应的抗体。这些研究结果表明，自身分子(包括fgfr1)具有抗原性，在特定的的条件下可以诱导产生抗自身分子的免疫应答。同时，目前已证实ag43具有十分强大的免疫原性(可以提供多种t、b细胞表位)，如果将外源抗原蛋白在ag43α结构域的148个氨基酸处插入，构成ag43的嵌合分子，能促使免疫系统产生对嵌合的外源蛋白的免疫反应，产生外源蛋白特异的抗体。基于上述思路，我们利用重组的ag43/fgfr1嵌合蛋白质作为疫苗免疫小鼠纤维肉瘤模型，借助ag43的强大免疫原性，完全有可能诱导免疫系统产生抗自身fgfr1的抗体，进而抑制小鼠肿瘤的生长。
研究结果发现ag43/fgfr1重组嵌合蛋白质疫苗主动免疫治疗可以有效抑制小鼠纤维肉瘤的生长。ag43/fgfr1组mvd明显降低，与对照组相比有明显差异，提示该组肿瘤组织中血管生成受到抑制最显著。进一步用western blot方法检测还发现ag43/fgfr1组免疫治疗后小鼠的血清中含有抗小鼠自身fgfr1的抗体，而其它对照组则无抗体产生。此外，elispot方法检测也发现ag43/fgfr1组免疫小鼠脾脏中分泌特异性抗小鼠fgfr1抗体的b淋巴细胞存在，与其它对照组比较差异有统计学意义。从这些结果可以推断，ag43/fgfr1重组蛋白质疫苗抗肿瘤的作用可能是ag43/fgfr1蛋白质疫苗诱导荷瘤小鼠体内产生了特异性抗自身fgfr1抗体，自身抗体阻断了bfgf与fgfr1间的信号传导通路，从而抑制肿瘤血管生成的结果。这一结果将为抗肿瘤血管生成治疗提供更多的实验依据,值得深入研究。
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