作者：吴娅娜,张克君,崔海宁,王正文,明松林
【摘要】 目的：探讨puma在移植胰腺缺血再灌注损伤(i/ri)中的早期促凋亡作用。方法：对封闭群大鼠建立大鼠腔静脉内分泌引流、肠道外分泌引流的动物模型.再灌注后第0、1、2、3、4、6、9、12 h等时点,每时点处死5只大鼠,切取移植胰腺,石蜡包埋切片,原位dna缺口末端标记(tunel)法测定胰腺组织细胞凋亡, western blot方法测定移植胰腺组织puma,bcl2、bax、caspase3蛋白表达。结果：再灌注术后第0、1、2、3、4、6、9、12 h,胰腺细胞凋亡数分别为(29.42±4.93)、(47.65±6.43)、(74.80±9.73)、(106.35±16.80)、(148.71±19.50)、(123.96±15.54)、(97.32±10.60)和(57.42±9.56)个/高倍视野。各时点均显著高于正常胰腺(23.48±4.26)。第4小时细胞凋亡数明显增高,12 h降低到最低值,不同组细胞凋亡数的差异有统计学意义(p<0.01);puma以及其下游的bax和caspase8蛋白表达在第4小时达到最高峰,12 h降低到最高值,bcl2在第4小时达到最低值,蛋白表达差异均有统计学意义(p<0.05),以后逐渐升高,12 h降低到最低值,puma表达与各时点的细胞凋亡数有明显的正相关(r=1.00,p<0.05)。结论：i/ri后细胞早期凋亡与puma活化有关,puma是通过调节下游bax、caspase8、bcl2基因发挥凋亡促进作用。
【关键词】 胰腺移植; 缺血再灌注损伤;凋亡;puma蛋白;大鼠
[abstract] objective: to study the proapoptosis effect of p53 upregulated modulator of apoptosis (puma) protein on ischemiareperfusion injury of rats stimulated during pancreatic transplantation.methods: rat models of pancreatic transplantation with venacava drainage and enteric drainage were established firstly. then 5 animals in each group were sacrificed respectively at different time points including 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9 and12 h after reperfusion, with pancreatic grafts being removed for apoptosic analysis by using dna nick end labeling technique and protein expression analysis of puma, bcl2, bax and caspase3 by using western blot method. results: under high power field, the numbers of apoptosic cells in pancreatic grafts at each time point was 29.42 ±4.93, 47.65 ±6.43, 74.8 ±9.73, 106.35 ±16.8, 148.71 ±19.50, 123.96 ±15.54, 97.32 ±10.6 and 57.42 ±9.56, respectively which are all significantly higher than the number in normal pancreatic tissues (23.48 ±4.26). it indicated the numbers were obviously increased at 4h after profusion while decreased to the minimum at 12h with significant difference among each group (p<0.01). the expression of puma, bax and caspase3 all started to upregulated at 1h after profusion and increased to maximum at 4h, then gradually decreased to minimum at 12h. while for bcl2, the expression started to downregulated at 1h after profusion and decreased to the minimum at 4h, then gradually increased to maximum at 12h. there are significant differences among the protein expression (p<0.05). besides, the puma expression is positively correlated to the number of apoptosic cells. (r=1.00, p<0.05). conclusion: cell apoptosis in ischemiareperfusion injury is highly correlated to the activation of puma. the proapoptosis effect of puma is generated by regulating bax, caspase8 and bcl2.
[key words] pancreas transplantation; ischemiareperfusion injury; apoptosis; puma protein; wistar
近年来大量研究表明,细胞凋亡是器官移植缺血再灌注损伤( ischemiareperfusioninjury, i/ri)的早期事件[1]，但细胞发生凋亡的机制不明。puma(p53 upregulated modulator of apoptosis)是2001年发现的p53下游促凋亡基因，是bcl2家族bh3亚家族中的成员，puma在受到p53缺氧、放射、化疗等刺激信号下迅速被激活，从而导致puma下游bcl2家族基因的活性改变，引起细胞色素c的释放和caspase酶的活化，最终导致细胞凋亡[2，3]。本研究应用大鼠胰腺、十二指肠移植模型, 探讨puma在大鼠胰腺、十二指肠移植i/ri中的早期凋亡促进作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物
43只(对照组3只)清洁级封闭群sd大鼠(供体), 体质量250～300 g ,雄性;清洁级封闭群wistar大鼠, 40只，体质量300～350 g, 雄性, 均由上海实验动物中心提供。
1.2 主要试剂
鼠抗人puma多克隆抗体购自cell signals公司，兔抗鼠bcl2 、bax、 caspase3、actin多克隆抗体和western bloting试剂购自santa cru公司,细胞凋亡检测试剂盒购南京建成生物工程研究所。
1.3 大鼠胰腺移植动物模型的制备
见文献[4]。
1.4 移植模型的分组和处理
移植模型共分为8组，每组5只;各组大鼠于胰腺再灌注后取移植胰腺。第1～8组分别于移植后0 、1、 2 、3、 4、6、 9、 12 h进行，取出胰腺立即放入-80 ℃冰箱中保存备用，其中以正常sd大鼠3只做对照。
1.5 tunel 法显示胰腺细胞凋亡
实验方法、结果判断、数据处理参见文献[5]
1.6 westernblotting检测蛋白表达
参照《分子克隆实验指南》提取冰冻移植胰腺细胞总蛋白，测定浓度后各取100 μg蛋白,以actin为内参照，westernblotting检测puma、bcl2 、bax、 caspase8蛋白表达。实验步骤按照说明书进行。采用北京赛智创业科技有限公司 champgeltm34进行 western blotting图像定量分析,计算各蛋白与内参actin的比值。
1.7 统计学处理
采用 spss 10.0统计软件包进行统计学分析，数据均数±标准差(±s) 表示。
2 结果
2.1 手术时间
供体手术时间 (47±2) min,袖套准备(2±1) min, 袖套吻合(3±1) min, 热缺血时间(2± 3)min, 受体手术时间(46±3) min,其中动脉吻合(10±2) min,冷缺血时间(52±5) min,与文献[4]的结果一致。
2.2 移植胰腺细胞凋亡的检测
再灌注术后第0、1、2、3、4、6、9、12 h,胰腺细胞凋亡数分别为(29.42±4.93)、(47.65±6.43)、(74.80±9.73)、(106.35±16.80)、(148.71±19.50)、(123.96±15.54)、(97.32±10.60)和(57.42±9.56)个/高倍视野,正常胰腺细胞凋亡数为(23.48±4.26)个/高倍视野,不同组细胞凋亡数的差异有统计学意义(v=42，t=2.785，p<0.01)。
2.3 凋亡相关基因的分析
puma、 bax、 caspase8表达自1 h开始表达上调,4 h表达最多,以后表达逐渐减少,12 h表达到最低;而bcl2 表达自1 h开始表达下调,4 h表达最少,以后表达逐渐增多,12 h达到最高,各自的表达差异均有统计学意义(p<0.05),见图1。puma表达与各时点的细胞凋亡数有明显的正相关( n=5,r=1.00,p<0.05)。
3 讨论
吴娅娜,等.puma在大鼠胰腺移植缺血再灌注损伤中的意义 实验结果显示，细胞凋亡数自移植灌注后1 h开始明显升高,4 h达到最高,以后逐渐下降,12 h达到最低,这与文献[1,6]的研究结果基本相同,说明细胞凋亡是胰腺移植i/ri后的早期事件。
western blot发现, puma在i/ri后4 h表达最明显,以后逐渐下降,12 h后降到最低水平,并且puma蛋白表达与细胞凋亡具有明显的正相关, 说明i/ri后早期细胞凋亡与puma高度活化有关。与此同时,puma下游bax、 caspase8促凋亡蛋白也遵循puma的表达变化,而puma下游的bcl2抑凋亡蛋白与puma的表达规律相反,说明puma是通过调节下游的bax、caspase8、bcl2基因发挥凋亡促进作用的。我们的实验提示,抑制puma基因活化可能有助于预防i/ri后早期细胞凋亡。该研究为以后的i/ri的防治提供了理论依据。
【参考文献】
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3 nakano kh. vousden. puma, a novel proapoptotic gene, is induced by p53[j].mol. cell,2001,12(7): 683694.
4 朱兴国，陈彦，李德春，等.大鼠胰十二指肠移植动物模型的制作[j].中华实验外科杂志,2005，22 (4 ):496497.
5 李占京,韩本立,吴军.胰腺移植急性排斥反应中的细胞凋亡[j].中华实验外科杂志，2000,17 (4):335336.
6 drognitz o, von dobschuetz e, kisslerb h, et al. organ procurement in experimental pancreas transplantation with minimal microcirculatory impairment[j]. eur surg res, 2004,36:185219.
