【摘要】 目的: 分段克隆昆明种小鼠磷酸二酯酶(pde) β亚单位编码基因pde6b cds序列全长, 分析比较昆明种小鼠与c57bl/6j小鼠pde β亚单位编码基因pde6b序列的差异。方法: 设计覆盖pde6b cds区的引物序列, 通过逆转录聚合酶链式反应扩增并克隆入载体pmd18t中, 转化大肠杆菌,酶切鉴定后测序。通过生物信息检索、 序列拼接并应用生物信息学相关软件进行序列分析。结果: 克隆了野生型昆明种小鼠的pde6b cds全长。昆明种小鼠与c57bl/6j小鼠pde6b cds区(nm_008806)相比较存在如下不同: 昆明种小鼠第706位碱基为a, 而数据库中序列nm_008806为g; 第1149位碱基前者为t, 后者为c。昆明种小鼠与c57bl/6j小鼠pde6b编码的蛋白序列差异并不明显, 仅有第236位氨基酸残基为甘氨酸（g）突变成丝氨酸（s）, 为相对保守性替换关系。结论: 克隆了昆明种小鼠pde6b cds 区全长序列; pde6b基因在不同种属小鼠之间编码序列存在差异, 表现出多样性特点, 但蛋白序列保守性较高。
【关键词】 视网膜色素变性 磷酸二酯酶 pde6b 多态性
[abstract] aim: to clone and sequence the phosphodiesterase 6 β subunit (pde6b) gene of kunming mice, and to compare it with counterpart sequences in the genbank database. methods: the primers were designed covering the cds region of the pde6b gene, and the corresponding fragments were amplified using rtpcr. the fragments were cloned into plasmids, amplified in e.coli, and sequenced. bioinformatics programs and online tools were used to analyze the sequences. results: the cds of the pde6b gene of kunming mice was cloned and sequenced. compared with the inbred mice c57bl/6j, pde6b cds sequence of kunming mice was different in some points: a g→a transition at +706, a c→t transversion at +1149. the protein sequence was of little difference: only a glycine→serine at +236. conclusion: the pde6b cds region of kunming mice was successfully cloned. pde6b sequences are of some level difference in different kinds of mice, but they are most conserved in protein level.
[keywords]retinitis pigmentosa; phosphodiesterase; pde6b; polymorphorism
磷酸二酯酶（phosphodiesterase, pde）在光传导过程中发挥着重要作用, 外界光子的刺激使视紫红质（rhodopsin）活化, 后者激活光转导素（transducin）, 活化的转导素又激活了视杆细胞中的pde, pde降解感光细胞内环磷酸鸟苷（cgmp）使其浓度降低。cgmp 是光感受器离子通道的特异性受体, 它的降解导致视杆细胞膜阳离子通道关闭, na+、 ca2+内流减少, 光感细胞超极化, 从而引起视觉冲动向视觉中枢逐级传递, 人们因此而感受到光线的刺激[1, 2]。现在已经发现, pde的异常在很多视网膜色素变性疾病患者中广泛存在[3, 4]。视杆细胞pde由α、 β和2个γ亚基组成, 其中α、 β为活性亚基, 与抑制性亚基分离后可以单独或者协同发挥生理功能。pde6b基因编码由856个氨基酸残基组成的pde β亚单位, 它的突变常常引起pde功能异常, 光传导链被切断, 并最终导致光感受器细胞的凋亡[5]。视网膜退行性变（retinal degeneration, rd1）小鼠是被人们广泛研究的一种视网膜色素变性小鼠模型, 致病基因被确定为pde6b[6], 其exon7上一个无义突变是导致疾病发生的原因[7]。在实验中发现一种视网膜退行性变小鼠（昆明种来源）, 遂将其与野生型昆明种小鼠交配而建立了家系。目前已经确定其遗传方式为常染色体隐性遗传, 其视网膜病变表现出发病早、 进展快的特点[8], 与文献报道的rd1小鼠很相似, 推测其可能也与pde6b基因的异常有关。由于公共数据库中缺乏昆明种小鼠的序列信息, 为了分析视网膜色素变性小鼠的pde6b基因的异常, 设计引物扩增pde6b cds并测序。
1 材料和方法
1.1 材料 野生型昆明种小鼠（16只, 8周左右, 体质量20～25 g, 雌雄各半）购自第四军医大学动物实验中心; trizol试剂、 datp为invitrogen公司产品; rtaq dna聚合酶（taqtm）、 dntps、 pyrobest dna聚合酶、 ecorⅰ、 hindⅲ内切酶、 t4 dna连接酶、 pmd18t 载体购自takara公司, amv逆转录酶、 oligo(dt)15 引物为promega公司产品; 凝胶回收试剂盒、质粒微量提取试剂盒为ugene公司产品。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 根据ncbi核酸数据库中nm_008806.1序列设计扩增pde6b cds序列的引物pde6b_ⅰ、 ⅱ、 ⅲ、 ⅳ、 ⅴ、 ⅵ和pde6b_ⅶ(表1), 参照文献[9]应用序列特异性引物聚合酶链反应（polymerase chain reacionsequence specific primer, ssppcr）方法扩增昆明小鼠pde6b基因相应片段。
表1 扩增pde6b cds序列的引物pde6b_ⅰ、 ⅱ、 ⅲ、 ⅳ、 ⅴ、 ⅵ和pde6b_ⅶ的引物序列（略）
tab 1 primers for amplifying fragments of the pde6b gene
1.2.2 视网膜总rna的提取 颈脱臼法处死16只昆明种小鼠, 无菌剪刀取眼球, 1×pbs漂洗, 显微镜下剪去眼前节, 将眼后节放入液氮速冻。
1.2.3 rtpcr 取眼后节组织约50 μg(单只小鼠双眼球, 16组)用trizol试剂提取视网膜总rna, 适量depc水溶解。2 μg total rna分别以oligo（dt）15 primer和基因特异性引物pde6b_ⅶ asp为引物用amv rt反转录酶反转录cdna。oligo（dt） 15 primer反转录体系为: 2.0 μg总rna, oligo（dt）15 primer 1.0 μg, 10 mmol/l4×dntps 2.5 μl, 总体积10 μl; gene specific primer pde6b_ⅶ asp反转录体系为: 2.0 μg总rna, 10 μmol/l pde6b_ⅶ asp 3.5 μl, 10 mmol/l4×dntps 2.5 μl, 总体积10 μl。70℃变性10 min, 立即置冰上5 min, 加入amv rt后置热循环仪上42℃反应60 min。pcr反应体系为10×pcr buffer 2.5 μl, 2.5 mmol/l dntps 2.0 μl, 10 μmol/l sp/asp 1.0 μl, cdna模板1.0 μl, 5 u/μl pyrobest dnapol 1.0 μl, ddh2o 17 μl。循环参数设置如下: 预变性95℃, 5 min, 变性95℃, 30 s, 退火53～54℃, 40 s, 延伸72℃, 40 s, 40个循环, 72℃, 7 min。pde6b_ⅰ、 pde6b_ⅲ、 pde6b_ⅵ退火温度为53℃, pde6b_ⅱ、 pde6b_ⅳ退火温度为54℃, pde6b_ⅴ、 pde6b_ⅶ 采用touchdown pcr方法扩增, 循环条件为: 预变性95℃, 5 min, 变性95℃, 30 s, 退火66℃0.5℃30 s 55℃, 延伸72℃, 40 s, 40个循环, 72℃, 7 min。
1.2.4 克隆载体的构建及序列测定 扩增产物在10 g/l琼脂糖凝胶上电泳分离, 紫外灯下切取目标片段, 用ugene h.q.＆q.凝胶回收试剂盒ⅱ进行胶回收。采用如下体系进行加a反应: 40 μl胶回收产物, 10×pcr buffer 5 μl, 2.5 mmol/l datps 5 μl, 5 u/μl rtaq 1.0 μl。反应完成后胶回收目的片段, 以10 μl体系连接, 16℃过夜。取过夜连接产物按照常规方法转化感受态细胞xl10。37℃孵箱中培养16 h后可见明显菌落生成, 挑取单克隆菌落37℃以200 r/min震荡培养过夜。无菌超净台中收取细菌, ugene h.q.＆q.质粒微量提取试剂盒提取质粒, ecorⅰ、 hindⅲ内切酶双酶切鉴定。将每个片段鉴定正确的至少3个克隆送公司测序。
1.2.5 序列分析 对于每只小鼠rtpcr扩增的各片段测序结果, 首先在ncbi上利用vecsreen程序查找并去除测序报告中的载体序列, 然后通过blasttn检索相关序列, 再将测序得到相同片段的采用clustal w (1.83)程序进行多序列比对, 对于不一致的个别碱基以2条序列相同者为正确, 提取出一条准确的序列; 然后将2条邻接序列进行序列比对, 去除重复序列后拼接出pde6b cds序列全长。对拼接出的16只昆明种野生小鼠pde6b cds序列全长与核酸数据库序列进行序列比对, 查找碱基突变位点。
2 结果
2.1 pde6b各片段基因扩增 用pyrobest高保真酶在53℃和54℃退火条件下扩增可分别得到pde6b_ⅰⅲⅵ和pde6b_ⅱⅳ片段, 用touch down pcr方法扩增得到了pde6b_ⅴ和pde6b_ⅶ片段, 各片段产物电泳结果如图（图1）。
图1 pde6b各片段扩增产物（略）
fig 1 electrophoresis of amplified pde6b fragments
m: dna marker; 1-7: pde6b_ⅰ、 ⅱ、 ⅲ、 ⅳ、 ⅴ、 ⅵ、 ⅶ.
2.2 序列分析 在ncbi上进行vector screen检索, 除去vector 序列, 进一步通过数据库blastn寻找高度相似序列, 然后相邻序列两两之间blast将重合序列去除, 从而拼接出昆明小鼠pde6b基因cds全长。昆明小鼠pde6b基因cds全长, 与数据库中小鼠pde6b mrna序列比对后发现存在如下序列多样性: 昆明种小鼠第706位碱基为a, 而数据库中序列nm_008806为g(图2a), 相应密码子分别为agc和ggc, 分别编码丝氨酸（ser, s）和甘氨酸（gly, g）; 第1149碱基前者为t, 后者为c(图2b), 相应密码子为gtt和gtc, 同为编码缬氨酸(val, v)的密码子。将核酸序列转换为蛋白序列之后进行序列比对发现昆明种小鼠的第236位氨基酸残基为甘氨酸（g）突变成丝氨酸（s）, 二者均是中性氨基酸, 为相对保守性替换关系; 二者同为野生型小鼠pdeβ亚单位的蛋白序列, 说明这种序列上的不一致并不影响蛋白质的功能结构域的形成, 不会造成疾病表型的出现。
图2 序列测定显示昆明小鼠与c57bl/6j小鼠pde6b开放读框的差异（略）
fig 2 the difference of pde6b orf between kunming and c57bl/6j mice
a: g→a transition at orf +706; b: c→t transversion at orf +1149.
3 讨论
pde6b基因编码视杆细胞pde β亚单位, 后者是pde的催化亚基, 发挥降解cgmp的作用, 而cgmp是视杆细胞外节盘膜上离子通道的特异性配体[10]。暗环境下, cgmp结合离子通道使其处于开放状态, na+、 ca2+内流, k+外流, 细胞处于静息状态。当外界光线增强时, 光子激活视杆细胞的光敏蛋白—视紫红质（rhodopsin）, 后者通过光致构象变化而活化, pde的活性亚基α和β降解cgmp, 使杆体细胞膜上阳离子通道关闭, na+、 ca2+内流减少, 细胞超极化, 把光学信号转化为电信号, 再经过电信号的转导、 编码和放大形成视觉信息向视觉中枢传递, 从而感知光线和图形变化[1, 2]。研究发现pde活性的丧失、 cgmp积聚和光感受器的凋亡同时存在[11]。pde蛋白的4个亚单位αβγγ的异常都可能引起功能失调, 特别是α和β亚单位的失活会使pde失去催化活性, 最终引起视杆细胞凋亡[12]。生物信息学分析, pdeβ亚单位二级结构由2个gaf结构域和一个pdease_ⅰ结构域组成, gaf结构域在光敏色素和cgmp pde中特异性存在, pdease_ⅰ结构域是催化活性中心, 这2种结构域上的异常可以引起常染色体隐性遗传的视网膜色素变性。
昆明种小鼠是一种封闭群动物, 野生型昆明种小鼠的pde6b序列仍不清楚; 通过小鼠兄妹交配的方法建立起基于昆明种背景的视网膜色素变性近交系小鼠, 实验中发现的视网膜退行性变小鼠的核酸序列是否存在突变要以野生型昆明种小鼠相应核酸序列为基础。因此对野生型昆明种小鼠pde6b基因cds区进行了序列测定, 发现其与公共数据库中的序列存在差异, 呈现多样性的特点。昆明种小鼠第706位碱基为a, 而数据库中序列nm_008806为g; 第1149碱基前者为t, 后者为c。蛋白序列上差异不明显, 仅有第236位氨基酸残基为甘氨酸（g）突变成丝氨酸（s）, 前者为疏水性氨基酸, 而后者为极性氨基酸, 为相对保守性替换关系。二者同为野生型小鼠pdeβ亚单位的蛋白序列, 说明这种序列上的不一致并不影响蛋白质的功能结构域的形成, 不会造成疾病表型的出现。
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