摘要： 目的 探讨大肠癌组织中多药耐药(mdr)基因产物肺耐药相关蛋白(lrp)、谷胱甘肽s转移酶π(gstπ)、拓扑异构酶 ii(topo ii)的表达及临床意义。方法 应用免疫组织化学max visiontm法检测122例大肠癌组织中lrp、gstπ和topoⅱ的表达情况，并结合临床病理因素进行分析。结果 ①在大肠癌组织中lrp、gstπ和topoⅱ表达的阳性率分别为88.5%，81.1%和77.05%;②lrp表达与性别、年龄、肿瘤大小、部位、临床分期、浸润深度、组织学类型等临床病理因素均无明显相关性(p>0.05);③gstπ在高、中分化腺癌中的阳性表达率明显高于低分化腺癌(p<0.05);④ topoⅱ的表达与大肠癌发生年龄有关，年轻患者其topoⅱ的表达明显高于≥59岁者(p<0.05)。结论 在未化疗过的大肠癌组织中，lrp 、gstπ、topo ii均有不同程度的高表达，其表达差异与其临床病理学特点具有相关性。因此，联合检测多药耐药基因，对于判断大肠癌患者的预后以及有效的个性化治疗具有重要意义。
关键词： 多药耐药基因;肺耐药蛋白;谷胱甘肽s转移酶π;拓扑异构酶ⅱ;大肠癌
大肠癌是我国常见的恶性肿瘤，近年来由于饮食结构的改变，发病率明显增高，并且趋向年轻化，成为我国重点防治的肿瘤之一。除手术治疗大肠癌外，化学药物治疗也是大肠癌术后治疗的一个重要手段。但是恶性肿瘤细胞产生的多药耐药性(multidrug resistance，mdr)是导致临床肿瘤化疗失败最常见而又最难解决的一个问题， mdr是指某种细胞毒药物的耐药细胞株对其结构和机制各异的药物产生耐药，有多种机制参与[1]。肺耐药相关蛋白(lung resistancerelated protein，lrp)、谷胱甘肽s转移酶π(glutathionestransferaseπ，gstπ)、拓扑异构酶ⅱ(topoisomerase ⅱ，topoⅱ)与mdr的产生有重要关系。本文检测了122例大肠癌中lrp、gstπ、topoⅱ的表达情况，并结合大肠癌临床病理特征进行分析，探讨其临床意义，为指导临床用药、判断预后提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 标本来源 收集滨州医学院附属医院2008年5月—2009年3月间手术切除的大肠癌组织标本，选取资料齐全的病例，共122例。所有的患者术前均未进行化疗，其中男61例，女61例;年龄30～88岁，平均年龄58.9 岁，<59岁 58例，≥59岁64 例。肿瘤大小：肿瘤直径≥5 cm者76例，<5 cm者46例;肿瘤部位：升结肠15例，横结肠3例，降结肠12例，乙状结肠22例，直肠70例;组织学类型：管状腺癌104例，黏液腺癌14例，印戒细胞癌2例，乳头状癌2例;分化程度：高分化59例，中分化50例，低分化13例;浸润深度：侵达黏膜或黏膜下层者6例，侵达肌层者19例，侵达浆膜或侵透浆膜层者97例;有淋巴结转移者49例，无淋巴结转移者73例。按国际癌症防治联合会(uicc)2002年的tnm分期，ⅰ期和ⅱ期共25例，ⅲ期和ⅳ期共97例。所有病例均为首次发现大肠癌，术前未行任何化疗、放疗。所有标本均经10%福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋。
1.2 试剂与方法 鼠抗人lrp、gstπ和topoⅱ单克隆抗体、max visiontm免疫组化试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司。将石蜡标本制成4 μm连续切片，染色程序严格按试剂盒说明书进行，以已知阳性的乳腺癌为阳性对照，以pbs代替一抗作为阴性对照。
1.3 结果判定 以出现棕黄色颗粒为阳性标志，lrp、gstπ阳性表达在胞浆，topoⅱ阳性表达在细胞核，高倍镜下计数5个视野或1 000个细胞，阳性细胞数≥10%为阳性，否则为阴性。
1.4 统计学处理 采用spss13.0统计软件行χ2检验和fisher精确概率法等方法对所得结果进行检验，p<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大肠癌中多药耐药基因的表达与患者的性别、年龄、肿瘤发病部位的相关性 122例大肠癌组织中lrp表达阳性的108例，阳性率为88.5%;gstπ表达阳性的99例，阳性率为81.1%;topoⅱ表达阳性的94例，阳性率为77.05%。本研究显示lrp、gstπ、topoⅱ在大肠癌组织中均具有较高的表达率，尤其以lrp的表达为著。但与患者性别、年龄、病变部位的相关性却不尽相同。topoⅱ的表达与大肠癌患者的年龄有相关性，在年龄<59岁的患者中topoⅱ的阳性表
达率为98.3%，明显高于年龄≥59岁的患者，差异具有统计学意义(χ2=5.17，p<0.05)，而lrp和gstπ的表达与患者的性别、年龄、肿瘤发病部位均无相关性(p>0.05)，见表1。表1 多药耐药基因与患者的性别、年龄、肿瘤发病部位的相关性
2.2 大肠癌中多药耐药基因与肿瘤大小、组织学类型、分化程度的相关性 在122例大肠癌组织中lrp、gstπ、topoⅱ的表达与肿瘤的大小、组织学类均无相关性(p>0.05)。对于不同分化程度的肿瘤，其耐药基因的表达有一定的差异。gstπ在高分化大肠癌组织中的表达率为89.8%，明显高于其在低分化癌中的表达率为69.2%，差异具有统计学意义(p<0.05)，而lrp和topoⅱ的阳性表达与肿瘤的分化程度无相关性(p>0.05)，见表2。表2 多药耐药基因与肿瘤大小、组织学类型、分化程度的相关性
2.3 多药耐药基因与肿瘤tnm分期的相关性 在122例大肠癌组织中lrp、gstπ、topoⅱ的表达与肿瘤的tnm分期、分化程度、浸润深度及淋巴结转移均无相关性(p>0.05)，见表3。表3 多药耐药基因与肿瘤tnm分期、浸润、转移的相关性
3 讨论
大肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，除手术治疗外，化疗是治疗大肠癌的一个重要手段，可用于术后辅助治疗，预防术后复发，有时也应用于术前以提高手术切除率。然而多数大肠癌患者的化疗效果并不理想，这与肿瘤细胞对化疗药物的耐受有关，多药耐药性是最为常见的原因。多药耐药性(multidrug drug resistance, mdr)是指肿瘤细胞不仅对一种抗肿瘤药物产生耐药，而且可对结构和作用机制不同的其他抗肿瘤药物产生交叉耐药，目前已知的抗肿瘤药物几乎都能发生耐药，因此认识和克服肿瘤的多药耐药性具有重要临床意义。肿瘤细胞的耐药机制是十分复杂的，临床表现为耐药时，既可能是一种耐药机制起作用，又可能是多种耐药机制共同作用的结果。因此，联合检测多个mdr指标，更能客观地反映肿瘤对化疗药物的耐药情况，并有助于化疗方案的选择及预后的判断[2]。lrp、gstπ、topoⅱ均是耐药标志物，测定结果可间接反映大肠癌组织中mdr基因的表达。lrp和gstπ的过度表达或活性增强、topoⅱ的含量减少或活性降低均是产生mdr的重要机制。
肺耐药蛋白(lung resistance protein，lrp)是近年新发现的与肿瘤细胞耐药有关的蛋白分子，最早在肺癌细胞中发现。lrp是人类主穹窿蛋白，非糖蛋白，包含869个氨基酸，蛋白分子量为110 kd，是核糖核蛋白颗粒的主要成分，由位于16号染色体短臂的lrp基因编码[3]。lrp在多种组织肿瘤中广泛表达，正常多表达在与外源物质接触并且有排泌功能的组织中，如支气管、消化道等，而在不同的肿瘤中lrp的表达差异可反映肿瘤对化疗的敏感程度，一种体外预警耐药的指标[4]。lrp在细胞中的表达多位于细胞浆，少部分位于核膜核孔复合体上，起到调节核及穹窿内外的物质分布的作用。研究发现，lrp主要通过调节细胞浆与细胞核之间的物质转运，阻止药物进入细胞核，降低药物分布的核质比例产生耐药，另外还可通过调节细胞浆内的囊泡运输而介导耐药[5]。研究发现，lrp在肿瘤细胞中的高表达可能与长春新碱、阿霉素、顺铂等抗肿瘤药物的耐药有关，并且与治疗效果、生存期等预后因素有负性相关。本研究结果显示lrp在大肠癌中高表达，阳性率为88.5%，表明其在大肠癌的原发性多药耐药中起重要的作用，但是本次研究未发现lrp的表达与患者的性别、肿瘤大小及临床分期等大肠癌的各项临床病理指标有明显相关性，这种结果与一些文献关于lrp表达与肿瘤的分化程度有相关性的报道不相符[6]，分析其原因可能与不同组织类型的肿瘤有关。大肠癌组织具有与外源物质接触和排泌的特点，这不仅是肿瘤的异质性，而是与肿瘤的组织发生、发生部位有关。因此无论分化程度如何，肿瘤细胞均具有lrp高表达的生物学活性。本研究结果提示大肠癌中广泛存在与lrp相关的耐药特性，应引起临床的足够重视。但由于大肠癌多以中高分化为主，对于本组病例也不除外由于样本量的限制导致其结果无差异性，如加大样本量是否能显示其意义还有待进一步研究。
gstπ是一种酸性谷胱甘肽s转移酶，属于谷胱甘肽转移酶gst一种亚型，其最初是从人胎盘中分离出的。gstπ是一种ⅱ期解毒酶，在人体正常组织中广泛表达，主要分布于参与解毒、排毒的组织中，如泌尿系统、消化系统、呼吸道等，其表达在恶性肿瘤中常增高。gstπ主要存在于胞浆中，其耐药机制主要是：①gstπ可以催化亲电物质烷化剂等与谷胱甘肽结合，增加药物水溶性，使其易排除体外;②gst
π本身可以与亲脂性细胞毒药物结合，促进其代谢，降低抗癌药物的细胞毒作用;③gstπ可以还原抗癌药物产生的过氧化物，使其转变为无毒物质从而介导耐药;④gstπ可以通过抑制烷化剂等亲电性的化疗药物引起的癌细胞的dna交联，降低化疗药物对细胞的杀伤作用，可见gstπ主要介导烷化剂、铂类、丝裂霉素类等药物的耐药[7]。
本实验中gstπ的阳性表达率为81.1%，较ranganathan等[8]报道的大肠癌中gstπ阳性率高，gstπ的高表达表明其是导致大肠癌原发性耐药的因素之一。另外本实验发现gstπ的表达与肿瘤的分化程度有相关性(p<0.05)，在高分化肿瘤的阳性率明显高于低分化者，表明高中分化的大肠癌患者比低分化患者更易产生烷化剂、铂类、丝裂霉素类等药物的耐药，这与一些关于恶性肿瘤中gstπ表达的研究结果一致。因此在临床上高分化患者应尽量避免选择此类药物。
拓扑异构酶广泛存在于生物体中，其保守性较强,主要存在于核仁，是一种在复制、转录、重组等过程中调整dna 链的螺旋状态不可缺少的酶。可分为i、ii 两类，其中拓扑异构酶ⅱ(topoⅱ)是在生理状态下发挥主要作用的拓扑异构酶，参与dna复制、转录、翻译等重要过程，因此topoⅱ可作为细胞的增殖指数。另外topoⅱ也是肿瘤化疗药物作用的重要靶点，其可以介导dna的断裂，并与其反应形成dna酶复合物，化疗药物主要通过干扰dna酶复合物的稳定性或直接抑制topoⅱ活性而影响癌细胞的增殖[9]。因此，topoⅱ含量越高则对topoⅱ抑制剂等化疗药物的敏感性越高，而topoⅱ表达下降或性质改变会影响复合物的形成，从而降低化疗药物的敏感性，产生耐药。
本研究中topoⅱ的阳性率为77.05%，而且其表达与患者性别、肿瘤大小、病变部位、tnm分期、分化程度、浸润深度及淋巴结转移无相关性，但是本研究与其它学者的研究结果[10]不同的是topoⅱ的表达与大肠癌患者的年龄有明显相关性，年龄<59岁的患者topoⅱ的表达明显高于≥59岁的肠癌患者，这表明老年大肠癌患者更易发生由topoⅱ介导的原发性耐药。因此，笔者认为对于不同年龄组的大肠癌患者，进行topoⅱ的检测具有重要的临床意义。
本研究结果表明，lrp、gstπ和topoⅱ都是大肠癌多药耐药的重要原因之一，lrp、gstπ和topoⅱ在肿瘤多药耐药方面的作用机制各不相同，其表达上的差异及其与大肠癌临床病理相关性的差异表明肿瘤的耐药性是多因素的。因此，临床上对大肠癌中多药耐药基因的联合检测不仅能揭示肿瘤的耐药特性，更重要的是能够判断预后并指导临床对肿瘤患者进行个性化治疗，选择合理的化疗方案，提高化疗效果，从而有效延长肿瘤患者的生存时间。
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