摘要：根据植物nbs-lrr类抗病基因同源序列（rga）的保守区域设计简并引物，从甘薯近缘野生种ipomoea grandifolia中扩增nbs-lrr类rga，得到7条nbs-lrr类rga，其编码的氨基酸序列包含nbs-lrr类rga所具有的保守的p-loop、kinase-2和kinase-3及glpl区。用dnaman软件对7个i. grandifolia nbs-lrr类rga及10个已知物种的nbs-lrr类rga氨基酸序列进行聚类分析，发现其聚为两类，两类之间的相似性较低，推测各类中相似性较高的序列分别属于同一个基因家族。
　　关键词：ipomoea grandifolia；nbs-lrr；抗病基因同源序列（rga）
　　中图分类号：s531 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2013）11-2680-04
　　甘薯[ipomoea batatas（l.） lam.]是重要的粮食、饲料、工业原料及新型能源用块根作物，中国是世界上最大的甘薯生产国，常年种植面积550万hm2，鲜薯产量约1.2×108 t，分别占世界甘薯种植总面积和总产量的60%和85%[1]。甘薯在遗传上高度杂合，种内、种间杂交不亲和以及遗传资源匮乏，遗传基础狭窄，病虫害、病毒病危害严重，制约了甘薯品种的遗传改良[2，3]。
　　抗病基因同源序列（resistance gene analog， rga）是一种存在于植物基因组中具有特定保守结构域的dna区段，具有容易获得、扩增结果稳定和使用成本低等优点。以rga区段的保守性为基础设计pcr特异简并引物扩增抗病基因同源序列，进而进行抗病基因的分离和克隆已经成为当前比较流行的克隆植物抗病基因的策略之一[4]。很多甘薯近缘野生种具有抗病虫、高干率、抗逆等优良基因[3]，目前已有关于从甘薯和甘薯近缘野生种三浅裂野牵牛（i. trifida）中分离出rga的报道，而有关从甘薯近缘野生种i. grandifolia中分离抗病基因的研究还未见报道[5-11]。本研究基于植物nbs-lrr类抗病基因的保守区域设计简并引物，获得甘薯近缘野生种i. grandifolia nbs-lrr类rga，为甘薯近缘野生种抗病基因的鉴定分离及甘薯品种的遗传改良研究奠定基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　甘薯近缘野生种i. grandifolia植株由中国农业大学刘庆昌教授惠赠，种植于湖北省农业科学院粮食作物研究所试验田，采集新鲜幼嫩叶片用于植物dna的提取。
　　1.2 方法
　　2 结果与分析
　　2.2 i. grandifolia nbs-lrr类rga的氨基酸序列分析
　　将pcr获得的甘薯近缘野生种i. grandifolia nbs-lrr类rga片段委托上海英骏生物技术有限公司进行序列测定，对测序结果进行分析，blast同源性比对结果发现有7个片段与ncbi中已登录的植物抗病基因及同源序列具有一定的同源性，可见利用简并引物进行同源扩增是分离i. grandifolia rga的有效方法。从结构上看，推导的rga氨基酸序列均具有p-loop（mggvgktt）、kinase-2（llvlddvw）和kinase-3（gsr/kilvttr）及glpl区（glplal）几个保守区（图2），这是nbs-lrr类基因共有的特征，据此可确定这7条序列均为nbs-lrr类抗病基因同源序列。比较i. grandifolia和甘薯的nbs-lrr类rga氨基酸序列，在92的位置上有差异，甘薯为a（丙氨酸）而i. grandifolia为v（缬氨酸）（图3）。
　　2.3 i. grandifolia与已知物种nbs-lrr类rga氨基酸序列的比对分析
　　将扩增得到的i. grandifolia nbs-lrr类rga基因序列和数据库中检索到的10条已知物种的nbs-lrr类rga基因序列进行同源性比对，构建系统发育树，结果见图4。由图4可知，这些序列聚成两大类，i. grandifolia的ig-11、ig-12、ig-28、ig-36、ig-42、ig-44与i. batatas的（aaz07902、abd33460）、毛果杨（populus trichocarpa）、蓖麻（ricinus communis）和马铃薯野生种（solanum bulbocastanum）的抗病相关基因聚成一大类，其中ig-11、ig-12、ig-28、ig-36、ig-42、ig-44与i. batatas的aaz07902、abd33460的同源性为95.29%～98.82%，推测它们来源于同一基因家族。序列ig-31与甘薯的ib-abd33456、三浅裂野牵牛的it-abh10960、菊芋（helianthus tuberosus）、甜瓜（cucumis melo）和夏葡萄（vitis aestivalis）的抗病相关基因聚成一大类，序列ig-31与菊芋抗病相关基因之间氨基酸序列的同源性为49.11%，可能属于同一基因家族。
　　3 讨论
　　同源序列克隆法具有过程相对简单、适用对象广泛等优点，采用同源序列克隆法已在水稻、甘蔗、结球甘蓝、柚等多种植物上获得了rga，显示了广泛的应用前景[13-15]，

些rga有的定位在某些抗病基因附近，为分子标记辅助育种提供了可能。本研究利用抗病基因的保守序列设计简并引物进行同源扩增，首次从甘薯近缘野生种i. grandifolia中分离出rga，比较i. grandifolia和甘薯nbs-lrr类rga的氨基酸序列，发现两个物种在第92个氨基酸位置上存在一个氨基酸的差异，该氨基酸的改变可能使i. grandifolia具有更强的抗病抗逆能力，同时该氨基酸可能是甘薯近缘野生种特有类型的抗病基因序列，这些序列的获得可为进一步分离并克隆甘薯的全长抗病基因奠定基础。 参考文献：
　　[1] 王红意，翟 红，王玉萍，等. 30个中国甘薯主栽品种的rapd指纹图谱构建及遗传变异分析[j].分子植物育种，2009，7（5）：879-884.
　　[2] 李 强，刘庆昌，马代夫.甘薯近缘野生种研究利用现状及展望[j]. 分子植物育种，2006，4（6s）：105-110.
　　[3] 曹清河，张 安，李 鹏，等.甘薯近缘野生种的抗病性鉴定与新型种间杂种的获得[j].植物遗传资源学报，2009，10（2）：224-229.
　　[4] 阙友雄，许莉萍，林剑伟，等. 甘蔗nbs-lrr类抗病基因同源序列的分离与鉴定[j].作物学报，2009，35（4）：631-639.
　　[5] 陈观水，周以飞，林 生，等.甘薯nbs类抗病基因类似物的分离与序列分析[j].热带亚热带植物学报，2006，14（5）：359-365.
　　[6] 林巧玲，曾会才.甘薯中nbs—lrr类抗病基因同源序列的克隆及序列分析[j].西北农业学报，2007，16（2）：65-69.
　　[7] chen g s， pan d r， zhou y f， et al. diversity and evolutionary relationship of nucleotide binding site-encoding disease-resistance gene analogues in sweet potato（ipomoea batatas lam.）[j]. journal of biosciences，2007，32（4）：713-721.
　　[8] 陈观水，潘大仁，周以飞，等. 三浅裂野牵牛nbs类抗病基因同源序列的克隆与分析[j]. 西北植物学报，2007，27（9）：1728-1734.
　　[9] 王 钰，王荣富，何国浩.甘薯抗病基因同源序列的克隆与分析[j].南京农业大学学报，2008，31（3）：81-86.
　　[10] lin q l， zeng h c. cloning and analysis of nbs-lrr type resistance gene analogues in sweet potato （ipomoea batatas）[j]. agricultural science and technology，2008，9（2）：76-80.
　　[11] wang y， rosen b， scoffield j， et al. isolation and analysis of resistance gene homologues in sweetpotato[j]. plant breeding， 2009，129（5）：519-525.
　　[12] cordero j， skinner d. isolation from alfalfa of resistance gene analogues containing nucleotide binding sites[j]. tag theoretical and applied genetics，2002，104（8）：1283-1289.
　　[13] 郑先武，翟文学，李晓兵，等.水稻nbs-lrr类r基因同源序列[j]. 中国科学：c辑，2001，31（1）：43-51.
　　[14] 曹必好，雷建军，夏 勇，等.结球甘蓝nbs-lrr类r基因同源序列的分离[j]. 中国农业科学，2004，37（7）：1081-1084.
　　[15] 黄代青，王 平，吕柳新.柚cdna中nbs-lrr类r基因同源序列的分离[j].中国农业科学，2005，37（10）：1580-1584.