目的 研究1例粘多糖病ⅳa型（mucopolysaccharidosis ⅳa，morquio a，mps ⅳa）患者的临床特点及n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶（galns）基因的突变。 方法 研究对象为1例散发粘多糖病ⅳa型患儿及50例正常儿童。分别取其外周血5 ml，提取dna，应用聚合酶链式反应（pcr）扩增galns基因的全部14个外显子，应用正反引物对pcr产物进行基因序列直接测序。 结果 该患儿未发现galns基因致病突变。但是检测出2个galns基因多态性1431a>g、1569+36a>g。 结论 galns基因突变不是本研究中1例散发mps ⅳa患儿的主要致病原因。
　　[关键词] 粘多糖病ⅳa型；galns基因；突变；分析
　　[中图分类号] r681.1 [文献标识码] a [文章编号] 1674-4721（2013）05（c）-0009-03
　　粘多糖病（mucopolysaccharidoses，mps），是由于溶酶体内特定水解酶遗传性缺乏而导致糖胺聚糖（glycosaminoglycan，gag）降解代谢障碍，代谢底物堆积，从而引起的一组具有相似表型的遗传代谢病。具体而言，是由体内降解糖胺聚糖的酶缺失或功能缺陷，导致未经完全降解的糖胺聚糖积聚在机体的不同组织，从而产生骨骼畸形、智能障碍等一系列临床症状和体征[1]。目前根据缺陷的酶及受累的代谢底物不同，将粘多糖病分为8型：mps ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅵ、ⅶ、ⅷ、ⅸ，每型又分若干亚型。除mpsⅱ型（即humer综合征）为x连锁隐性遗传外，其余均为常染色体隐性遗传[2]。其中mps ⅳ型又称morquio综合征，于1929年由乌拉圭儿科医生morquio和英国放射学家的brailsford分别报道，包括mps ⅳa（omim 253000）和mps ⅳb（omim256540）两个亚型，分别由n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶（galns）和β-d-半乳糖糖苷酶（β-gal）缺乏所致[3]。本组疾病因全身结缔组织均可有过多的粘多糖沉积，故可出现全身各系统的症状，主要表现为身材矮小、面容较丑陋，如表情淡漠、头大、眼裂小、眼距宽、鼻梁低平、鼻孔大、唇厚、前额及双颧突起、毛发多而发际低、颈短、下颌明显、不同程度的智力减退等。有的类型可出现角膜混浊、关节进行性畸形、胸廓畸形、脊柱后凸或侧凸、膝外翻、爪形手、早期出现肝、脾大、耳聋、心脏增大等[4]。根据所缺乏酶的不同，临床表现亦有所差异。本研究对1例散发mps ⅳa患儿的临床特点及基因研究，结果报道如下：
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料
　　患儿，男，6岁，发现畸胸3年，身材矮小1年余。2012年7月3日入院，患儿系第1胎第1产，足月剖宫产出，头先露，出生体重2900 g，身长不详；无窒息史，生后母乳喂养。3个月时会翻身，9个月会走，说话，智力正常。3岁时家长发现前胸隆起明显，给予口服钙剂至今。近一年家长发现患儿生长发育落后于同龄儿，不伴智力低下、异常步态等。患儿父母非近亲婚配，其家族中未发现类似情况。查体：卧位身高101.1 cm，坐高89 cm，体重16.5 kg，身高和体重在同年龄同性别的第3百分位以下。智力正常，眼距宽，塌鼻梁，下颌前突，颈短，鸡胸，助缘外翻，脊柱右侧弯，心、肺、腹（-），四肢未见明显畸形。血ca：2.43 mmol/l（正常：2.1～2.8 mmol/l），血p：1.62 mmol/l （正常：0.96～1.62 mmol/l），alp：202 u/l（正常：40～110 u/l）。tsh：4.16 μiu/l（正常：0.17～4.20 μiu/l），ft3：7.77 pmol/l （正常：3.10～6.8 pmol/l），ft4：16.51 pmol/l （正常：10～23 pmol/l）。pth：26.31 pg/ml （正常：15～65 pmol/l），肝肾功能正常。尿酸性黏多糖定性试验（甲苯胺蓝）阳性。x线检查：第10肋以下肋骨明显变宽，呈飘带样改变。椎间隙正常，椎体变扁，骨密度减低。两侧髂骨翼外展，髂骨体缩短，髋臼不规则，股骨干增粗，干骺端变细，骨质普遍稀疏。参加本研究的50名正常对照儿童群，均来自太原地区及周边地区。
　　1.2 研究方法
　　1.2.1 基因组dna提取 经研究对象同意并签署知情同意书后，各取患儿及对照人群（包括患儿父母）外周血5 ml，用tiangen公司生产的血液基因组dna提取试剂盒提取外周血基因组dna。
　　1.2.2 引物设计 由http：//www.genatlas.org/获得galns基因的14个外显子序列（nt-010542）及cdna序列（nm-000512），参考文献[5]及使用primer 3软件设计覆盖galns基因14个外显子的14对引物，并委托北京诺赛基因组研究中心有限公司合成。
　　1.2.3 pcr扩增 对galns基因的所有外显子及其邻近内含子进行pcr扩增

反应体系为25 μl，包括25 mm mgcl2 1.5 μl、10×taq buffer 2.5 μl、2.5 mm dntp 2 μl、taq dna聚合酶1.25 u、5 pmol/μl正反引物各2 μl、基因组dna 1 μl。反应条件：预变性94℃ 5min，变性94℃ 1 min，退火58～66℃ 30 s（退火温度由具体引物而定），延伸72℃ 1 min，共35个循环，延伸72℃ 10 min。取pcr产物3 μl，1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，在gis凝胶图像处理系统中观察其是否存在及其片段大小。
　　1.2.4 pcr产物直接测序 以pcr引物作为测序引物，委托北京诺赛基因组研究中心有限公司对pcr产物进行测序反应。反应结束后，对延伸产物进行dna序列分析。对测序异常的片段重新进行pcr扩增，正向、反向测序3次，验证结果的可靠性。测序结果应用dnastar软件包中的seqmantm软件及edit seq软件与正常galns基因组序列进行对比，并用http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp数据库验证。
　　对该患儿的galns基因全部14个外显子及其部分邻近内含子进行检测，未发现基因突变，但发现出2个snp：1431a>g、1569+36a>g，这2个基因变异在ncbi属下的基因多态性数据库（snp库）中已公布。我们还在正常对照组50例健康儿童中检测到了这2个变异。这2个变异均为纯合变异。
　　3 讨论
　　mps ⅳa为一种少见的遗传性粘多糖代谢障碍性疾病，主要导致儿童生长发育迟缓、丑陋面容、骨骼畸形、步态异常、肝脾大、眼角膜混浊等，但智力正常，但也有进行性智力减退的报道。骨的改变包括：鸡胸、脊柱后凸畸形，膝内翻或外翻等。牙的改变主要表现为牙釉质发育不良、牙齿稀疏多形、牙颊面及咬合面点状小凹。该病男女均可发病，男多于女，一般在1岁左右即出现侏儒，3～4岁症状明显。naoto yamada等[6]根据临床表现将mps ⅳa分为轻型、重型和中间型。轻型5岁前生长发育正常，仅有轻度的骨骼异常，一般无膝外翻、驼背、短肢、短颈等表现，成年身高>150 cm，20岁前生存质量不受影响。重型在3岁半之前即可出现膝外翻、驼背、短肢、短颈等早期症状，成年身高<125 cm，15岁左右骨骼病变进行性发展，严重影响生存质量。中间型表现介于两者之间。2007年montano am等[7]根据身高将mps ⅳa分为轻型（>140 cm）、中间型（120～140 cm）和严重型（<120 cm）。
　　本研究中患儿6岁，3岁时家长发现前胸隆起明显，近一年家长发现患儿生长发育落后于同龄儿。查体：卧位身高101.1 cm，坐高89 cm，体重16.5 kg，身高和体重在同年龄同性别的第3百分位以下。智力正常，眼距宽，塌鼻梁，下颌前突，颈短，鸡胸，助缘外翻，脊柱右侧弯。查血钙、血磷正常，alp偏高；甲功检查：tsh正常，ft3偏高，ft4正常。尿酸性黏多糖定性试验（甲苯胺蓝）阳性。
　　mps ⅳa为常染色体隐性遗传，其致病基因galns基因定位于染色体16q24.3，其中包含14个外显子和13个内含子，外显子长约50 kb，cdna全长为2339 bp，其编码区为1566 bp，编码的galns含有522个氨基酸[8-9]。目前已报道的galns基因突变已有170 多种，其中大部分为错义突变和小缺失[10]。2012年s.khedhiri等[11]对6个突尼斯mps ⅳa患者进行研究，发现了galns基因的两个新突变：-ivs1+1g-a和g66r，这两个突变均为致畸突变。2012年s.catarzi等[12]对1例意大利mps ⅳa患者研究发现了一个新突变236g>a，该突变为纯合的错义突变，由于母系单亲二倍体所致。最近francyne kubaski等[13]对1例巴西患儿研究又发现了一个新的突变492a>g，但仍需进一步的研究证明基因型与表现型之间是否存在联系。galns基因是否还存在新的突变尚未明确。此外，国内对mps ⅳa的研究并不多，国内mps ⅳa患儿是否存在与国外mps ⅳa患儿相同的突变还有待于进一步研究。
　　本研究中对1例mps ⅳa患儿的galns基因全部外显子及其部分邻近的内含子进行pcr扩增及dna序列测序，但未发现任何基因突变，表明galns基因突变不是该患儿的主要致病原因。但是，检测到2个snp：1431a>g、1569+36a>g，其中1431a>g位于外显子13，1569+36a>g位于外显子14以外的非编码区。2011年sonia pajares等[14]对14例西班牙mps ⅳa患者进行galns基因分析时也发现了这两个snp，这2个snp在ncbi下属的snp数据库中已公布，均为纯合变异，均不能引起蛋白质发生改变，为galns基因多态性[10]。为了明确galns基因多态性的发生情况，本研究检测了50名对照人群中这2个基

因多态性的发生情况，结果显示在50名人群中均可检出这2个基因多态性，进一步证实了1431a>g、1569+36a>g是galns基因多态性，与snp数据库公布的结果一致。
　　总之，本研究对象未检测出galns基因突变，但发现了2个galns基因多态性，表明galns基因突变不是该患儿的主要致病原因。
　　[参考文献]
　　[1] 王云. 单基因遗传病的突变筛查与体外表达系统鉴定[d]. 北京协和医学院硕士研究生毕业论文，2010.
　　[2] wibke müller-forell，gudrun schulze frenking，yasmina amraoui，et al. mucopolysaccharidoses （mps）：clinical and neuroradiological aspects of the different types[j]. clinical neuroradiology，2007，32（1）：143-158.
　　[3] catherine prat，olivia lemaire，johan bret，et al. morquio syndrome： diagnosis in an adult[j]. joint bone spine，2008，75（4）：495-498.
　　[4] benedict j.a，lankestera，michael whitehouse，et al. morquio syndrome[j]. current orthopaedics，2006，20（2）：128-131.
　　[5] l. carraresi a，r. parini b，c. filoni，et al. galns gene expression profiling in morquio a patients' fibroblasts[j]. clinica chimica acta，2008，397（1-2）：72-76.