的 探究电针对阿尔茨海默病（ad）大鼠学习记忆能力改善的情况以及对大鼠海马tau蛋白磷酸化的影响。 方法 将雄性sd大鼠30只随机分成正常组、模型组和电针组，每组10只。除正常组外，其余两组侧脑室各注射β淀粉样蛋白多肽片段aβ25-35制备动物模型。电针组治疗分为3个疗程。以morris水迷宫来评价大鼠的学习和记忆能力，并且使用western blot法来检测大鼠海马区tau蛋白和其丝氨酸198位点、404位点磷酸化水平，利用软件分析测定western blot图像条带的光密度（od）值。 结果 模型组morris水迷宫试验逃避潜伏期比正常组长（均p < 0.05），电针组与模型组差异有统计学意义。3个组之间海马区tau蛋白总量的差异无统计学意义，与模型组比较，电针组丝氨酸的198和404位点的tau蛋白磷酸化tau蛋白水平具有降低（均p < 0.05）的趋势。 结论 电针治疗显著并且能减轻ad大鼠海马tau蛋白磷酸化水平，改善ad模型大鼠学习记忆能力。
　　[关键词] 阿尔茨海默病；电针；tau蛋白；磷酸化
　　[中图分类号] r-33 [文献标识码] a [文章编号] 1674-4721（2013）05（c）-0016-03
　　老年性痴呆亦称阿尔茨海默病（alzheimer' s disease，ad），它是一种极其常见的中枢神经系统退行性疾病，由于病因及发病机制至今不清，发病以后很难治愈，给患者的日常生活也带来了很大的不便。ad患者脑内含有大量的以异常过度磷酸化的tau蛋白为主要成分的神经元纤维缠结（nfts）[1]，有研究[2]发现ad患者的痴呆程度与神经原纤维的缠结数目具有密切的关系，而神经原纤维增粗扭曲形成缠结正意味着神经元趋于死亡，因此也可以验证出ad患者的痴呆程度与神经原纤维的缠结数目是呈正相关[3]趋势增长的说法。所以可以大胆地推断海马tau蛋白的过度磷酸化其实就是ad的核心原因。而电针治疗通过电流微弱的刺激大鼠海马区域，以此来增强其活性，通过激活磷酸酯酶活性，来限制ad患者脑tau蛋白异常过度磷酸化，从而进一步改善ad的发病症状。此实验初步探究电针刺激大鼠海马区，旨在证明电针能改善ad大鼠的记忆能力，抑制tau蛋白异常过度磷酸化，进而延缓ad的发展并改善其症状。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验动物
　　健康的sd雄性大鼠60只，体重180～200 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供（批号：2010002）。在实验室稳定条件下饲养1周。
　　1.2 主要试剂及仪器
　　戊巴比妥钠（上海索莱宝生物科技有限公司）；ab25-35（美国chemicon公司）；tau-5单克隆抗体、tau-1单克隆抗体、p-tau（s396）多克隆抗体（biosource公司）；脑立体定位仪（narishige sn-2型）；morris水迷宫（北京硕林苑科技有限公司）；全能脉冲电疗仪（6805-c型）（汕头市医用设备厂有限公司）；无菌针灸针（北京健乐康医疗器械有限公司）。
　　1.3 动物造模
　　将大鼠称重并用4%戊巴比妥钠进行腹腔麻醉注射之后，将大鼠固定在大鼠脑立体定位仪上，并且可以参照《大鼠脑立体定位图谱》先对大鼠进行最常规的消毒，然后切口于颅顶正中矢状，将骨膜分离，用锥颅器快速钻开颅骨，使硬脑膜完全暴露出来。于前囟1.3 mm，矢状缝左右旁开1.6 mm，垂直3.5 mm，用微量注射器对每侧侧脑室各注射aβ25-35（实验前将其溶于0.9%氯化钠溶液中，配置成浓度10%）。用微量注射器将aβ25-35在3 min内缓慢注入，留针5 min，充分浸润局部组织，缓慢拔出微量注射器。第3天重复注射试剂，剂量相同，正常组不用注射药品。
　　1.4 分组和治疗
　　将雄性sd大鼠30只随机分成正常组、模型组和电针组，每组10只。电针组：第2次水迷宫测试结束后，用毫针针刺“百会”穴，平刺约2.5 mm，“大椎”穴，直刺约4 mm。“百会”穴、“大椎”穴连接6805-c型全能脉冲电疗仪，频率为30 hz，电压为2 v，强度是以肢体轻微抖动为宜，用针刺大鼠双侧“太溪”穴，双侧“肾俞”穴，直刺进针5 mm，双侧 “足三里”穴，直刺进针4 mm，间歇5 min捻转一次，每日1次，时间40 min。7 d为1个疗程，间歇1 d，治疗3个疗程后进行行为学测试。正常组：给予正规的饲养，模型组：造模后常规饲养。
　　1.5 morris水迷宫测试
　　迷宫水池中的平台位于东北象限正中，水面高出平台100 cm，将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中，记录其在2 min内寻找到并爬上平台的时间即逃避潜伏期。潜伏期最长时间120 s。分别在治疗前后进行游泳实验

，大鼠每次在2 min内寻找到并爬上平台的时间为大鼠的记忆成绩，每日2次，连续5 d，然后计算出测试结果的平均成绩。
　　1.6 检测大鼠海马tau蛋白含量
　　第2次大鼠进行水迷宫试验结束后，将其断头取脑，分离双侧海马，放入冰箱中冷冻保存，用western blot法来检测大鼠海马区tau蛋白的含量。在1 ml组织裂解液匀浆中加入双侧海马，等待离心5 min后提取上层清液，并利用考马斯亮蓝法进行蛋白浓度的测定，将各组所得蛋白调整成等浓度的溶液样品。等量蛋白样品经过10% sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到pvdf膜封闭2个小时，加入一抗（tau-5检测tau蛋白总量，tau-1检测198位点非磷酸化tau蛋白，s396 tau检测404位点磷酸化tau蛋白），孵育过夜，洗膜3次，加入二抗室温孵育2 h，洗膜13次。凝胶成像仪拍摄图像，image j软件测定平均光密度（od）值。
　　1.7 统计学分析
　　采用spss 17.0统计软件分析包，进行单因素方差分析，组间比较用t检验，统计结果以x±s表示，p < 0.05为差异有统计学意义。 　　2.1 各组大鼠morris水迷宫试验逃避潜伏期比较
　　治疗前模型组和电针组的时间延长与正常组比较差异有统计学意义（均p < 0.05），治疗后模型组大鼠的逃避潜伏期的平均值相对于正常组和电针组的时间长，差异有统计学意义（均p < 0.05）。见表1。
　　2.2 各组大鼠海马tau蛋白含量比较
　　tau-5蛋白3组间的含量差异无统计学意义，与模型组相比电针组海马tau-1含量明显偏高，但是s396 tau蛋白的含量却明显比模型组（均p < 0.05）低很多，s396 tau蛋白含量及电针组海马tau-1的含量与正常组相比，它们之间的差异无统计学意义。见表2。
　　3 讨论
　　老年性痴呆又称阿尔茨海默病（alzheimer's disease，ad），是中枢神经系统（cns）退行性疾病。患者中最具特征性的神经病理改变就是神经元内出现大量的神经原纤维缠结，神经原纤维缠结（nft）多出现在海马、皮质以及基底前脑的神经元中，其病理特征为大脑皮质及海马等处的老年斑（sp）和nft[4]。在ad患者中，其病理条件下，tau蛋白会不断的发生异常过度磷酸化的改变，因此会丧失与微管相互结合的能力，而且这些磷酸化的蛋白会聚集在一起并形成 nft（也就是说会使大量的神经元纤维缠结），结果会导致微管解聚，破坏了细胞的正常骨架，更会损坏正常轴突的转运系统，由此导致了突触丢失并引发退行性的病理改变。而神经原纤维缠结主要是由双股螺旋纤维构成的，tau蛋白过度磷酸化会形成各种各样的同分异构体，这些异构体正是双股螺旋纤维的主要成分，细胞之中tau蛋白过度磷酸化是ad最早出现的病理改变之一[5]。有关的最新研究表明[6-8]，关于aβ所导致的失忆和生理行为的缺陷，其实都是依赖于tau蛋白分子所具有的独特功能。因此，怎样预防并改善tau蛋白过度磷酸化是现代化科学对ad病理学研究的关键性所在。
　　tau蛋白是在1975年weingarten等在采用猪脑分离纯化微管蛋白的同时，被首次分离出来的一种与微管的组装具有密切关系的含磷糖蛋白。它能使微管的功能和结构维持正常稳定的基础，而且它的功能也受到磷酸化水平调节，tau蛋白构象改变的主要原因之一就是其过度磷酸化所导致的，它也会因此丧失促微管组装的生物学活性及功能，而且对蛋白水解酶的抗性增加，会产生神经毒性[9-11]，进而危害机体健康。tau蛋白在ad患者脑内磷酸化程度高出正常人3～4倍。在ad患者的大脑内存在3种tau蛋白，一是细胞质正常tau蛋白（c-tau），二是过度磷酸化易溶型tau蛋白（adp-tau），第三种是聚集成phf的tau蛋白（phf-tau）。到目前为止，在phf-tau中已经鉴定出45个磷酸化位点[12]，其中主要是苏氨酸和丝氨酸残基发生过度磷酸化，本实验是在丝氨酸的198和404位点展开进行的。电针通过对大鼠海马区的刺激，来增强细胞活性，通过激活磷酸酯酶活性，来限制ad患者脑tau蛋白异常过度磷酸化，从而进一步改善ad的发病症状。
　　祖国医学认为，脑为髓海、精明之府，肾藏精，生髓，通于脑，髓由肾中精气化生。《素问·宣明五气篇》曰：“肾藏志。”志，即为记忆、学习能力。清·林佩琴《类证治裁》曰：“夫人之神宅于心，心之精根于肾，而脑为元神之府，精髓之海，实记忆之所凭也。”说明肾中如若精气充盈，则神清气朗，耳聪目明。由此用“百会”“大椎”“太溪”“肾俞”“足三里”组成针灸治

疗，通过影响中枢神经系统，能抗氧化，以及改善突触形态可塑性及长时程增强效应，来直接或间接提高ad大鼠的学习记忆能力[13-15]。本实验结果显示，针能减低aβ所致的tau蛋白在198和404位点磷酸化水平，提示电针治疗有一定的抑制tau蛋白磷酸化的作用，这将有助于神经元微管系统的稳定，起到保护神经元的作用。
　　[参考文献]
　　[1] 王建枝. tau蛋白基因突变与神经退行性疾病[j]. 生命的化学，1999，19（6）：288-290.
　　[2] lee vm，balin bj，otvos l，et al. a68：amajor subunitofpairedhelical filaments and derivatized forms of normal tau[j]. science，1991，251：675.
　　[3] braak h. neuroanatomy of alzheimer diseaes[j]. alzheimers research，1997，33：235-247.
　　[4] 万章. tau蛋白过度磷酸化在阿尔茨海默病发病机制中的作用[j]. 医学研究生学报，2010，23（5）：539-542.
　　[5] dermaut b，kumar-singh s，rademakers r，et al. tau is central in the genetic alzheimer-frontotemporal dementia spectrum[j]. trends genet，2005，21（12）：664-672.
　　[6] lapointe ne，morfini g，pigino g，et al. the amino terminus of tau inhibits kinesin dependent axonal transport：implications for filament toxicity[j]. j neurosci res，2009，87（2）：440-451.
　　[7] clavaguera f，bolmont t，crowther ra，et al. transmission and spreading of tauopathy in transgenicmouse brain[j]. nat cell biol，2009，11（7）：909-913.